Zájemci z USA a Kanady, vyžádejte si ZDARMA vzorek naší soupravy SYNERGY™ 2.0 pro extrakci rostlinné DNA na bázi CTAB ZDE.
Izolace DNA z rostlinných tkání může být velmi náročná, protože biochemické rozdíly mezi různými druhy rostlin mohou být extrémní. Na rozdíl od živočišných tkání, kde stejný typ tkáně z různých druhů má obvykle podobné vlastnosti, mohou mít rostliny proměnlivé hladiny metabolitů a strukturních biomolekul. Polysacharidy a polyfenoly jsou dvě třídy rostlinných biomolekul, které se mezi jednotlivými druhy značně liší a jsou při izolaci DNA velmi problematické. Kontaminující polysacharidy a polyfenoly mohou narušit manipulaci s DNA po izolaci.
K dispozici jsou metody, které účinně odstraňují polysacharidy a polyfenoly z preparátů rostlinné DNA. Použití CTAB (cetyltrimethylamoniumbromidu), kationtového detergentu, usnadňuje separaci polysacharidů během purifikace, zatímco přísady, jako je polyvinylpyrolidon, mohou pomoci při odstraňování polyfenolů. Extrakční pufry na bázi CTAB se široce používají při čištění DNA z rostlinných tkání.
Jedna z možností čištění DNA pomocí CTAB využívá toho, že polysacharidy a DNA mají v CTAB různou rozpustnost v závislosti na koncentraci chloridu sodného. Při vyšších koncentracích soli jsou polysacharidy nerozpustné, zatímco při nižších koncentracích je DNA nerozpustná. V důsledku toho lze úpravou koncentrace soli v lyzátech obsahujících CTAB polysacharidy a DNA různě vysrážet.
Polyfenoly jsou sloučeniny, které obsahují více než jeden fenolový kruh (např. tanin), což je struktura, která se velmi účinně váže na DNA. Přirozeně se vyskytují v rostlinách, ale vznikají také při poškození tkání rostlin (hnědnutí). Při homogenizaci rostlinných tkání jsou polyfenoly syntetizovány uvolněnou polyfenoloxidázou. Přídavek polyvinylpyrrolidonu zabraňuje interakci DNA a fenolických kruhů tím, že na sebe polyfenoly váže.
Protokoly založené na CTAB obvykle fungují velmi dobře, ale jednou z podstatných nevýhod je, že k oddělení organických rozpustných molekul od DNA se běžně používají chloroformové extrakce. Vzhledem k tomu, že chloroform je karcinogenní, mnoho institucí jeho používání odmítá. Společnost OPS Diagnostics proto vyvinula alternativní metodu, která se chloroformu vyhýbá; najdete ji na stránce Synergy™ Plant DNA Extraction Kit.
Materiály
- CTAB pufr: CTAB: 2% cetyltrimethylamoniumbromid, 1% polyvinylpyrrolidon, 100 mM Tris-HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA nebo extrakční pufr CTAB
- Centrifuga (až 14 000 x g)
- Roztok RNázy A
- Izopropanol
- 70% etanol
- 2 ml odstředivky
- SpeedVac
- TE pufr (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA)
Metoda
Vzorky rostlin lze připravit kryogenním rozmělněním tkáně v hmoždíři a tloučku po zchlazení v tekutém dusíku. Zmrazením vysušené rostliny lze rozemlít při pokojové teplotě. V obou případech je pro extrakci DNA nejlepší jemný prášek.
- Na každých 100 mg homogenizované tkáně použijte 500 µl extrakčního pufru CTAB. Promíchejte a důkladně promíchejte. Homogenát přeneste na 30 minut do lázně o teplotě 60 °C.
- Po uplynutí inkubační doby homogenát odstřeďujte 5 min. při 14 000 x g.
- Přeneste supernatant do nové zkumavky. Přidejte 5 µl roztoku RNázy A a inkubujte při 37 °C po dobu 20 minut
- Přidejte stejný objem chloroformu/isoamylalkoholu (24:1). Vortexujte po dobu 5 sekund a poté vzorek odstřeďujte po dobu 1 minuty při 14 000 x g, aby se fáze oddělily. Horní vodnou fázi přeneste do nové zkumavky. Tuto extrakci opakujte, dokud není horní fáze čirá.
- Přeneste horní vodnou fázi do nové zkumavky. Precipitujte DNA přidáním 0,7 objemu studeného isopropanolu a inkubujte při -20 °C po dobu 15 minut.
- Centrifugujte vzorek při 14 000 x g po dobu 10 minut. Dekantujte supernatant, aniž byste narušili peletu, a následně promyjte 500 µl ledově studeného 70% ethanolu. Dekantujte etanol. Odstraňte zbytkový ethanol sušením ve vysavači SpeedVac.
- Sušte peletu dostatečně dlouho, abyste odstranili alkohol, ale bez úplného vysušení DNA. Rozpusťte DNA ve 20 µl TE pufru (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). Aby se peleta rozpustila, může být nutné ji zahřát.
Volitelný protokol:
Použitím křemíkových spinových kolonek lze získat DNA vyšší kvality. Volitelný protokol naleznete zde.
.