Abstract
Makrofágy hrají důležitou roli v obraně hostitele, kromě silné schopnosti fagocytovat patogeny nebo cizorodé látky. Plní řadu rolí při regulaci imunity, hojení ran a zachování homeostázy tkání. Makrofágy se vyznačují vysokou heterogenitou, mohou se polarizovat přinejmenším na dva hlavní extrémy, makrofágy typu M1 (klasická aktivace), které jsou obvykle odvozeny z monocytů, a makrofágy typu M2 (alternativní aktivace), což jsou většinou ty makrofágy, které sídlí ve tkáních. Na základě procesu hojení ran v kůži předchozí studie dokumentovaly, jak se tyto různé podtypy makrofágů podílejí na reparaci a remodelaci tkání, zatímco mechanismus působení makrofágů při hojení střevních anastomóz dosud nebyl stanoven. Tento přehled shrnuje v současnosti dostupné důkazy týkající se různých rolí polarizovaných makrofágů ve fyziologickém průběhu hojení anastomózy a jejich patologické role při úniku z anastomózy, nejnebezpečnější komplikaci po gastrointestinální operaci.
1. Úvod
Makrofágy jsou myeloidní imunitní buňky, které hrají ústřední roli v zánětu a obraně hostitele . Tyto buňky se vyznačují silnou schopností fagocytózy a mají zásluhu na ochraně hostitele před infekcí prostřednictvím procesu tzv. vrozené imunity . V posledních letech se s nahromaděním důkazů makrofágy ukázaly jako jedny z nejuniverzálnějších buněk. Jejich role se posunula od imunitních efektorových buněk, které provádějí obranu hostitele jen jako „popeláři“, k dominantním „režisérům“ a „vykonavatelům“ pro regulaci zánětlivé odpovědi, udržování homeostázy tkání, účasti na hojení ran a remodelaci tkání .
Makrofágy se aktivně podílejí na procesu hojení ran, přičemž jejich role ve speciální chirurgické ráně, známé také jako anastomotická rána, nebyla dosud plně stanovena. Anastomózu vytvářejí chirurgové po odstranění gastrointestinálního nádoru nebo resekci střeva za účelem rekonstrukce pokračování gastrointestinálního traktu. Abnormální hojení anastomózy se může vyvinout v anastomotický únik (AL), definovaný jako únik luminálního obsahu z chirurgického střevního spojení . Jedná se o nejnebezpečnější komplikaci po kolorektální operaci , protože je zodpovědná až za 40% pooperační úmrtnost, prodloužení hospitalizace a zvýšení nákladů na zdravotní péči v důsledku léčby sepse a nutnosti reoperace .
Z makroskopického hlediska patří mezi příčiny AL především komunikace, infekce a poruchy hojení . Podrobný mechanismus na buněčné úrovni však zatím nebyl vzhledem k omezenému množství důkazů stanoven. V tomto přehledu se na základě heterogenních populací makrofágů a jejich protichůdných tendencí polarizace přikláníme k diskusi o úloze různých typů makrofágů při bezproblémovém hojení anastomózy a o jejich patologické úloze při anastomotickém úniku.
1.1. Makrofágy v anastomóze Podtypy makrofágů
Dlouho se předpokládalo, že makrofágy neboli mononukleární fagocyty pocházejí z hematopoetických kmenových buněk (HSC). Převládající dogma tvrdilo, že všechny makrofágy pocházejí z monocytů a jsou jimi také doplňovány . Buňky rodiny makrofágů (buňky mononukleárního fagocytárního systému) však vykazují pozoruhodnou heterogenitu, a to jak v morfologii, tak v biologických funkcích . Tyto nejnovější údaje zpochybnily dlouho zastávanou představu o „HSC-monocytech-makrofágu“ . Důkazy ukázaly, že tkáňové makrofágy, jako jsou Kupfferovy buňky jater, epidermální Langerhansovy buňky kůže a mikroglie mozku, pocházejí ze žloutkového váčku a mohou přetrvávat u dospělých myší nezávisle na HSC . Tyto makrofágy sídlící ve tkáních se mohou obnovovat in situ, i když v určitých situacích mohou být také doplňovány krevními monocyty. Na rozdíl od makrofágů odvozených od monocytů, které se účastní antibakteriálního procesu během akutní zánětlivé reakce, tkáňově rezidentní makrofágy vyjadřují odlišné funkční vlastnosti a hrají ústřední roli při udržování architektury, funkce a homeostázy tkání , přičemž jejich úloha při hojení anastomózy je dále popsána níže.
Rozmanitost a plasticita byly uznány za charakteristické znaky makrofágů, které přispívají k jejich značné heterogenitě. Obecně lze polarizaci makrofágů rozdělit na dva hlavní extrémy, tj. klasickou aktivaci, jejímž výsledkem jsou makrofágy typu M1 (M1), a alternativní aktivaci, jejímž výsledkem jsou makrofágy typu M2 (M2). Tyto dva typy makrofágů provádějí různé funkční fenotypy v reakci na signály z mikroprostředí, jako jsou mikrobiální produkty, poškozené buňky a cytokiny z aktivovaných lymfocytů. Konkrétně ligandy receptorů podobných Toll (TLR) a interferon-γ (IFN-γ) mohou vyvolat polarizaci makrofágů na makrofágy typu M1; naopak interleukin-4 (IL-4) a interleukin-13 (IL-13) vyvolávají polarizaci makrofágů na makrofágy typu M2 . Takové vysvětlení však nemusí plně ilustrovat všechny různé scénáře aktivace. Murray a kol. navrhli, že mezi M1 a M2 by měly existovat ještě další podtypy , včetně podskupiny M2a indukované IL-4 a IL-13, podskupiny M2b aktivované imunitními komplexy (TLR) a podskupiny M2c deaktivované glukokortikoidy, transformujícím růstovým faktorem (TGF) nebo interleukinem-10 (IL-10) . Kromě toho se také uvádí, že by mohl existovat doplňkový podtyp M2 (M2d), který je vyvoláván agonisty TLR a adenosinem . Zdá se, že na polarizaci makrofágů je třeba pohlížet jako na pokračující spektrum, na jehož opačných koncích se nacházejí dva typy makrofágů (M1 a M2). Jiná klasifikace polarizace navržená Mosserem a Edwardsem předpokládá, že makrofágy jsou aktivovány do tří populací, které mají na starosti obranu hostitele, hojení ran, respektive imunitní regulaci . Autoři klasifikovali makrofágy spíše na základě jejich základních funkcí než podnětů. V souladu s dříve diskutovanou koncepcí paradigmatu „M1-M2“ je většina makrofágů odvozených od monocytů klasicky aktivována a vyjadřuje fenotyp M1, který vykonává obranu hostitele; naopak makrofágy sídlící ve tkáních jsou aktivovány převážně alternativní cestou, která vyjadřuje charakteristiku podobnou M2 a zachovává homeostázu tkáně a řešení zánětu .
1.2. Úloha polarizovaných makrofágů při fyziologickém hojení anastomózy
Stěna trávicího traktu obsahuje čtyři vrstvy (tj. sliznici, submukózu, muscularis propria a serózu). U klasické obrácené střevní anastomózy konec na konec přiložením serózy zmizí mezera mezi oběma konci trávicího traktu a vznikne bariéra, která izoluje sterilní břišní dutinu od luminálního obsahu a bakterií; navíc je tato vrstva důležitá při poskytování matrice pro fibroblasty . Submukóza se skládá z krevních cév, lymfatik a nervových vláken; tato vrstva je zdrojem fibroblastů, které se po operaci zažívacího traktu aktivují a začnou ukládat kolagen. Sešitá nebo sešitá kolagenní vlákna v této vrstvě zajišťují většinu pevnosti anastomózy v tahu ; proto má submukóza velký význam při hojení anastomózy. Slizniční vrstva hraje také roli při udržování homeostázy, která umožňuje proces hojení. Bazén makrofágů v gastrointestinální sliznici je největším bazénem tkáňových makrofágů v těle a dlouhodobá absence nebo dysfunkce makrofágů zhoršuje hojení anastomózy .
Oprava a hojení tkání po poranění jsou studovány již po staletí, ale zůstávají pochopeny pro omezený objekt, tj. kůži. Na rozdíl od ní je hojení gastrointestinálního traktu anatomicky skryté před kontrolou a umožňuje chirurgovi posoudit úspěšnost operace pouze na základě parametrů celkové pohody pacienta . Mezi hojením kůže a anastomózy existují určité rozdíly, včetně anatomie (např. u kožních tkání neexistuje ekvivalentní anatomická složka serózy) a aktivity kolagenu a kolagenázy . Klasická odpověď na poranění se však vyskytuje ve všech orgánech a tkáních . Fyziologický průběh hojení anastomózy lze také rozdělit do tří překrývajících se, ale odlišných fází, které zahrnují zánět, tvorbu nové tkáně a remodelaci (obrázek 1) .
1.2.1. PAMP: patogen-asociované modifikační vzorce. Zánět
Kromě infekce různými mikrobiálními faktory mohou poranění nebo traumata, jako je například chirurgický zásah, vést také k nepatogennímu zánětu, který lze dále rozdělit na časnou a pozdní zánětlivou reakci . V časné zánětlivé fázi se neutrofily nejprve rekrutují z cirkulující krve do lokální poraněné tkáně (oblast anastomózy). Tyto rekrutované polymorfonukleární buňky odstraňují místní cizorodé částice nebo bakterie a poté podléhají apoptóze nebo nekróze. Poté se rekrutují monocyty, které se diferencují v makrofágy s vysokou fagocytační schopností. Fagocytují poškozené neutrofily a další tkáňové zbytky, aby chránily před dalším poškozením tkáně. Během této fáze jsou makrofágy v reakci na patogenní modifikační vzorce (PAMPs) v kontaminujících podmínkách nebo na modifikační vzorce spojené s poškozením (DAMPs) ve sterilních podmínkách klasicky aktivovány a vyjadřují fenotyp M1 . Makrofágy M1 uvolňují vysoké koncentrace prozánětlivých cytokinů, jako je tumor nekrotizující faktor α (TNF α), interleukin 1β (IL 1β), interleukin 6 (IL 6) a interleukin 12 (IL 12), proteázy a reaktivní formy kyslíku (ROS), které jsou považovány za důležité pro zabíjení mikrobů a prozánětlivou reakci. Makrofágy M1 mohou také produkovat kolagenázu, vysoce aktivní enzym, který způsobuje degradaci kolagenu, což má za následek nízkou pevnost anastomózy brzy po vytvoření anastomózy . V pozdní fázi zánětu, při nadměrné fagocytóze apoptotických neutrofilů, zapojení β2 integrinů na makrofázích apoptotickými neutrofily aktivuje makrofágy k expresi protizánětlivého mediátoru transformujícího růstového faktoru (TGF) . Naopak produkce prozánětlivých cytokinů jako TNF-α a IL-1β byla inhibována . Fenotyp makrofágů se tak mění z prozánětlivého M1-like na protizánětlivý M2-like . Tyto makrofágy produkují cytokiny, jako je IL-10, a vytvářejí základ pro tvorbu nové tkáně vylučováním dalších růstových faktorů, jako je vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) . Protože se makrofágy stimulované IL-10, TGF nebo glukokortikoidy in vitro polarizují do podtypu M2c, který sdílí podobnosti s protizánětlivými makrofágy , naznačuje to, že protizánětlivé makrofágy patří k makrofágům typu M2c a jsou schopny zesílit svou protizánětlivou odpověď vylučováním IL-10 a TGF ve zpětnovazební smyčce. Kromě toho se ukázalo, že protizánětlivé a regenerační schopnosti protizánětlivých makrofágů jsou zcela závislé na IL-10 ve sterilním prostředí, například v chirurgické ráně .
1.2.2. Tvorba nové tkáně
V této fázi makrofágy sídlící ve tkáni nebo rekrutované z periferní krve, známé jako profibrotické makrofágy, vytvářejí různé růstové faktory, například TGF, destičkový růstový faktor (PDGF), fibroblastový růstový faktor-2 nebo inzulínu podobný růstový faktor-1 . TGF je profibrotický cytokin, který působí na fibroblasty a aktivuje je k diferenciaci na myofibroblasty v ranné tkáni. Myofibroblasty produkují hmotu složek extracelulární matrix (ECM) včetně kolagenu a fibronektinu, aby vyplnily defekt tkáně. V případě gastrointestinálního traktu mohou kolagen produkovat také buňky hladkého svalstva . Podtypy kolagenu v gastrointestinálním traktu jsou kolageny I, III a V, ve srovnání s výhradně kolagenem I a III v kůži . Účinnými kontraktilními silami myofibroblastů mohou být roztržené tkáně rány spojeny a obnovit svou integritu . Mezitím profibrotické makrofágy a aktivované fibroblasty uvolňují proangiogenní faktory, jako je VEGF, které vyvolávají příchod endoteliálních progenitorových buněk k ranné tkáni a podporují tak tvorbu nových cév (angiogenezi). Invaze kapilár zvyšuje prokrvení místních tkání a usnadňuje anastomotické hojení. Studie hojící se sliznice tlustého střeva králíků po experimentální excizi navíc ukázaly, že hojnost mezenchymálních buněk v hojících se vrstvách střevní svaloviny doprovází kapilární invazi; tyto buňky se mohou diferencovat v buňky hladké svaloviny a histiocyty, které jsou pravděpodobně zodpovědné za obnovu hladké svalové tkáně . Profibrotické makrofágy, myofibroblasty a novotvary dohromady tvoří granulační tkáň, nejdůležitější základní kompartment v normálním průběhu hojení rány . Tyto profibrotické makrofágy jsou funkčně klasifikovány jako makrofágy podobné M2a , protože mohou být indukovány in vitro pomocí IL-4 a IL-13 . Není však jasné, zda lze protizánětlivé a profibrotické makrofágy jasně rozlišit in vivo, a zdá se, že plasticita makrofágů vytváří během hojení rány směs nebo kontinuální posuny variant .
1.2.3 . Remodelace
Remodelace anastomózy je dynamický proces zrání uvnitř zhojené tkáně, který je založen na rovnováze mezi ukládáním a odbouráváním ECM a remodelací tkáně . Pro udržování této dynamické rovnováhy je rozhodující část makrofágů sídlících ve tkáni označovaná jako fibrolytické makrofágy. Produkují matrixové metaloproteinázy, jako je matrixová metaloproteináza-2 (MMP2), matrixová metaloproteináza-9 (MMP9), matrixová metaloproteináza-12 (MMP12) a matrixová metaloproteináza-19 (MMP19) , které rozkládají makromolekuly matrix, tj. kolagen, jednu z nejdůležitějších složek ECM. Submukóza je pevnostní vrstvou gastrointestinálního traktu a je tvořena převážně kolagenem a remodelace této vrstvy rozhoduje o pevnosti anastomózy. V závislosti na MMP vylučovaných fibrolytickými makrofágy se původně uložená kolagenní vlákna přeskupují a zesíťují, remodelují z kolagenu typu III na kolagen typu I; ten je mnohem pevnější. Kromě toho fibrolytické makrofágy také regulují degradaci syntézou tkáňového inhibitoru metaloproteináz (TIMP), který může inhibovat činnost MMP. Kromě toho jsou fibrolytické makrofágy zodpovědné za indukci apoptózy fibroblastů, následné odstranění apoptotických buněk a potlačení dalšího zánětu prostřednictvím uvolňování IL-10 . Fibrolytické makrofágy se navrhují klasifikovat jako makrofágy podobné M2c, které mohou být in vitro vyvolány apoptotickými buňkami a IL-10 .
Makrofágy se tedy podílejí na celém fyziologickém průběhu hojení anastomózy. Mezi třemi hlavními fázemi tkáňové reparace vyjadřují makrofágy v různých fázích různé fenotypy. Ve stavu normální opravy tkáně existují nejméně čtyři druhy makrofágů: (1) prozánětlivé makrofágy, (2) protizánětlivé makrofágy, (3) profibrotické makrofágy a (4) fibrolytické makrofágy. Pokud tyto čtyři druhy makrofágů roztřídíme podle paradigmatu „M1-M2“, mohou prozánětlivé a profibrotické makrofágy odpovídat makrofágům typu M1, respektive M2a. Zatímco protizánětlivé i fibrolytické makrofágy pravděpodobně patří makrofágům typu M2c .
1.3. Role makrofágů v anastomotickém leaku
Jak jsme již dříve uvedli v našem přehledu, výskyt AL obsahuje především tři faktory: komunikaci, infekci a poruchy hojení. Komunikací se rozumí defekt trávicí trubice v oblasti anastomózy, která spojuje gastrointestinální lumina a dutinu břišní. Infekce označuje bakteriální infekci v místě anastomózy. Poruchy hojení zahrnují všechny látky, které narušují normální proces hojení, jako je hypoxie nebo zánět. Tyto tři faktory na sebe aktivně působí: dojde k působení jednoho faktoru a spustí se reakční řetězec, který se skládá ze všech faktorů a nakonec vede k AL. Například infekce vyvolává zánětlivou reakci v místě anastomózy, která narušuje ukládání kolagenu , následně narušuje normální proces hojení a vede ke komunikaci mezi intra- a extraluminální stěnou gastrointestinálního traktu. Komunikace naopak umožňuje dislokaci střevního obsahu (včetně bakterií) do dutiny břišní, způsobuje intraabdominální infekci a následně zpomaluje hojení anastomózy. Z klinického hlediska je komunikace v určitém rozsahu považována za makroskopický klinický důsledek, zatímco infekce a poruchy hojení jsou durativní biologické procesy. U AL se na posledních dvou mechanismech podílejí především makrofágy, což lze pozorovat i u jiných špatně se hojících ran .
Infekce anastomózy může být způsobena dehiscencí anastomózy (únik střevního obsahu do sterilní dutiny břišní) nebo před/intraoperační kontaminací. Bez ohledu na příčinu infekce se v kontaminovaném infekčním prostředí makrofágy polarizují na typ M1, jak bylo uvedeno výše. Avšak namísto podpory rezistence vůči intracelulárním bakteriím a kontroly akutní fáze infekce je nadměrný nebo dlouhodobý program M1 pro pacienty škodlivý, jak bylo prokázáno u akutních infekcí Escherichia coli . E. coli jako rezidentní flóra střeva může vyvolat typický profil M1 prostřednictvím rozpoznání lipopolysacharidů (LPS) pomocí TLR4 . Klasické aktivované makrofágy typu M1 zvyšují expresi inducibilní syntázy oxidu dusnatého (iNOS), která je zodpovědná za tvorbu oxidu dusnatého (NO). Nejprve bylo zjištěno, že NO zprostředkovává arteriální vazodilataci, a poté bylo zjištěno, že má úlohu v obraně hostitele proti patogenům . Kromě toho byla popsána významná úloha NO při ukládání kolagenu, fibróze a tvorbě jizev . Vysoké hladiny NO v ráně, stejně jako při infekci nebo zánětu, vážně narušují syntézu kolagenu v ráně . Snížené ukládání kolagenu vážně oslabuje pevnost anastomózy, což může vést k selhání hojení anastomózy. Nesprávná polarizace makrofágů M1 při bakteriální infekci dutiny břišní tedy přispívá ke vzniku AL.
Úloha makrofágů při úniku s poruchami hojení je složitější. Za normálního stavu je oprava tkáně iniciována odklízením tkáňových zbytků a odumřelých buněk, účinnou fagocytózou těchto „tkáňových odpadků“ makrofágy a je rozhodující pro včasné vyřešení zánětu a úspěšné hojení. Nicméně u pacientů komplikovaných diabetem, v pokročilém věku nebo po chemoterapii je schopnost makrofágů fagocytovat silně ovlivněna, což přímo vede k hromadění apoptotických nebo nekrotických buněk v místě anastomózy. Toto hromadění mrtvých buněk prodlužuje zánětlivou fázi, narušuje proces hojení a ohrožuje řešení zánětu . Další poruchy, jako je ischemie nebo anastomotická hypoxie, vážně ohrožují hojení anastomózy . Na buněčné úrovni vede vystavení makrofágů anoxickému prostředí k expresi prozánětlivých cytokinů jako IL-1β a TNF-α a cytotoxických mediátorů jako NO , což naznačuje, že hypoxie může podporovat polarizaci makrofágů do fenotypu M1 . Nadměrně aktivované makrofágy M1 udržují prozánětlivou odpověď a brání následným krokům reparačního procesu, který ovlivňuje správné hojení a remodelaci anastomózy , a příslušný mechanismus je popsán výše.
Na základě dostupných důkazů se zdá, že klasické aktivované makrofágy, které exprimují fenotyp M1, jsou zodpovědné za patologický proces defektního hojení anastomózy, zatímco alternativně aktivované makrofágy, které exprimují fenotyp M2, hrají rozhodující roli při řešení zánětu a úspěšné reparaci tkáně (obrázek 2). Ačkoli se makrofágy typu M1 účastní časné fáze normálního hojení rány, programovaná transformace jejich polarizované orientace z M1 na M2 položí základ přechodné zánětlivé odpovědi a následné regenerace tkáně.
2. Závěr
Makrofágy jsou nejvšestrannější imunitní buňky a mají značnou plasticitu a heterogenitu. Makrofágy se mohou polarizovat do dvou hlavních extrémů a vyjadřovat odpovídající fenotypy (M1 a M2). Protože polarizace je předpokladem k tomu, aby makrofágy mohly vykonávat své rozmanité biologické funkce, hrají různé polarizované makrofágy různé role ve fyziologickém procesu hojení anastomózy a v patogenezi AL. Opětovné poznání AL z pohledu makrofágů přispívá ke zkoumání nových diagnostických nástrojů a terapeutických cílů. Například v různých fázích zotavení po konstrukci anastomózy se může objevit změna spektra cytokinů a zánětlivých mediátorů, jako jsou IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, ROS a NO, které jsou vylučovány makrofágy. Hladina těchto látek by navíc mohla nepřímo odrážet situaci v anastomóze. Abnormální kolísání těchto látek pravděpodobně ukazuje na poruchu a defekt hojení anastomózy, což lze považovat za předzvěst AL. Protože makrofágy typu M1 vykazují stimulační účinek na AL a makrofágy M2 jsou nezbytné pro hojení anastomózy, regulace polarizace M1/M2 může v budoucnu najít svou terapeutickou roli v léčbě AL.
Konflikty zájmů
Autoři prohlašují, že v souvislosti s publikací tohoto článku nedošlo ke konfliktu zájmů.
Příspěvky autorů
Jinyao Shi a Zhouqiao Wu jsou prvními autory.
Poděkování
Tento článek byl podpořen Pekingskou městskou komisí pro vědu a technologie (č. D141100000414004 a Z151100004015070) a Pekingskou městskou komisí pro zdraví a plánování rodiny (č. 2014-1-2151).