Struktura membránové adenylylcyklázy vázané na aktivovaný stimulační G protein

Membránově integrované adenylylcyklázy (AC) jsou klíčové proteiny v přenosu signálu u savců, které reagují na širokou škálu extracelulárních a intracelulárních signálů a generují cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) pro řadu následných signálních událostí (1, 2). Membránové AC integrují více signálních kaskád – například propojují vstupy z receptorů spřažených s G proteiny (GPCR), změny intracelulární koncentrace Ca2+ (3) a lipidové signální kaskády (4). U savců existuje devět podtypů AC, klasifikovaných jako AC1 až AC9 (5). Na základě aminokyselinové sekvence mají všechny podtypy AC stejnou celkovou předpokládanou architekturu. Jsou to polytopní membránové proteiny, které se skládají z 12 transmembránových (TM) šroubovic a mají cytosolické N a C zakončení. Po prvních šesti TM doménách (TM1-TM6) polypeptidu AC následuje cytosolová oblast, která zahrnuje katalytickou doménu (C1a), dále následuje doména C1b, druhá TM oblast, svazek TM7-TM12, a poté druhá katalytická doména (C2a) a C-koncová doména C2b. N- a C-koncové části proteinů jsou velmi variabilní, zatímco nejkonzervativnějšími částmi jsou domény C1a a C2a, které patří k nukleotidylcyklázám třídy III (5, 6). Rentgenová krystalografie chimérického AC5C1/AC2C2 v komplexu se stimulační podjednotkou G proteinu Gαs (7, 8) odhalila klíčové rysy katalytického aparátu AC a pomohla při formulaci detailního mechanismu produkce cAMP G protein-dependentními AC (7, 8). Každý ze savčích membránových AC však obsahuje další strukturní prvky, jako je membránově se rozprostírající doména a šroubovitá doména (HD), které jsou rozhodující pro správné sestavení těchto proteinů a pro jejich enzymatickou funkci.

S klonováním prvního savčího AC přišel návrh, že AC se mohou podobat transportérům (9). První studie AC u Paramecium naznačily, že TM část proteinu může mít funkci iontového kanálu (10). V souladu s jejich kanálovou funkcí je sekvence TM části AC Paramecium homologní s napěťově řízenými draslíkovými kanály (11). Přítomnost polytopního svazku šroubovic TM a cytosolické domény vázající adenosin 5′-trifosfát (ATP) naznačuje povrchovou strukturní a funkční podobnost s transportéry ABC (ATP-binding cassette). Neexistuje však žádná podstatná sekvenční podobnost mezi AC a jakýmikoliv známými proteiny podobnými transportérům nebo iontovým kanálům. Studie mykobakteriálních a savčích ACs naznačily možnou úlohu TM domén při správném sestavení enzymu (7, 12, 13). Strukturní a funkční úloha oblasti TM však zůstává nejasná.

AC9 je podtyp cyklázy exprimovaný v mnoha tkáních, včetně plic, mozku a srdce (14, 15). Byla hojně studována ve spojení s komplexy A-kinázového kotevního proteinu (AKAP) (16). Bylo navrženo, že AC9 je prostřednictvím AKAP Yotiao spojen s draslíkovými kanály IKs, proteinkinázou A, fosfodiesterázou PDE4D3 a proteofosfatázou PP1 (17). AC9 byl identifikován jako potenciální lékový cíl u astmatu (5). rs2230739, polymorfismus AC9, který vede k mutaci Ile772→Met, je spojen se změnami v odpovědi na inhalační kortikosteroid budesonid (18). V kanonickém modelu aktivace AC se forskolin váže na alosterické místo sousedící s katalytickým místem, což vede k aktivaci enzymu. Interakce mezi AC a podjednotkou Gαs ve stavu navázaném na guanosin 5′-trifosfát (GTP) rovněž vede k aktivaci AC, přičemž maximální aktivace AC je dosaženo v přítomnosti forskolinu i proteinu Gαs. Ačkoli však porovnání sekvencí s jinými AC ukazuje, že AC9 obsahuje alosterické místo, a jedna z předchozích zpráv naznačuje, že forskolin může aktivovat AC9 (14), několik studií dospělo k závěru, že AC9 je na forskolin necitlivý, a v této oblasti panuje shoda, že AC9 stojí ve své vlastní kategorii jako protein necitlivý na forskolin (19, 20).

Ac dlouho zůstávaly chybějícím kouskem v našem chápání přenosu signálu, pravděpodobně kvůli uznávaným obtížím při expresi a purifikaci těchto proteinů pro biochemické a strukturní studie (21). Abychom tuto mezeru zaplnili, stanovili jsme strukturu hovězího AC9 v komplexu s Gαs (AC9-Gαs) pomocí kryoelektronové mikroskopie (kryoEM) a analýzy jednotlivých částic.

Exprimovali a purifikovali jsme hovězí AC9 (obr. S1A) a potvrdili jeho funkční integritu pomocí testů akumulace cAMP (obr. 1, A až C). Purifikovaný protein katalyzoval přeměnu ATP na cAMP a mohl být inhibován MANT-GTP (2ʹ-/3ʹ-O-(Nʹ-methylanthraniloyl)guanosin-5ʹ-O-trifosfát), inhibičním substrátovým analogem AC (obr. 1B). Rekonstituce proteinu s GTPγS aktivovaným Gαs (obr. S1, B a C) vedla k robustní aktivaci cyklázy (obr. 1A). Testy schopnosti univerzálního aktivátoru AC forskolinu aktivovat AC9 in vitro odhalily velmi slabou aktivaci AC9 při submilimerních koncentracích (obr. 1A). Naproti tomu forskolin dokázal aktivovat komplex AC9-Gαs se střední účinnou koncentrací (EC50) 111 μM (obr. 1A a tab. S2). Ačkoli tedy forskolin i podjednotka Gαs byly schopny částečně aktivovat protein, plné aktivace bylo možné dosáhnout pouze kombinací obou látek. Navíc, jak se očekávalo od alosterického modulátoru AC, forskolin posunul medián inhibiční koncentrace (IC50) substrátového analogu AC9 MANT-GTP směrem k nižší koncentraci (obr. 1, B a C). Naše experimenty in vitro s použitím purifikovaného proteinu AC9 plné délky a proteinu Gαs tedy jasně ukazují, že forskolin působí na proteinový komplex AC9-Gαs jako klasický alosterický aktivátor.

Připravili jsme zmražené, hydratované kryoEM mřížky obsahující komplex AC9-Gαs v přítomnosti MANT-GTP a forskolinu v koncentracích (0,5 mM pro každý ligand) přesahujících hodnoty IC50 a EC50 pro tyto dvě sloučeniny a podrobili je jednočásticové kryoEM analýze (obr. S2). Výsledkem nejlepší podskupiny částic byla mapa hustoty odpovídající kompletnímu komplexu cyklázy a podjednotky G proteinu, zpřesněná na rozlišení 3,4 Å (obr. 1D). Kompletní hustotní mapa spolu s mapami získanými po cíleném zpřesnění membránových (obr. S3) a cytosolových (obr. S3) částí komplexu nám umožnila sestavit kompletní trojrozměrný (3D) model komplexu AC9-Gαs (obr. 1E). Mapa a model odhalily několik klíčových prvků komplexu AC9-Gαs: (i) svazek 12-TM domén AC9, (ii) HD spojující svazek TM a katalytickou doménu AC9 a (iii) katalytickou doménu AC9 vázanou na GTPγS aktivovanou podjednotku Gαs (obr. 1, D a E, a obr. S6).

Doména TM proteinu má pseudodvojnásobnou symetrii, což je vlastnost, která se často vyskytuje u transportérů rozpuštěných látek z rodiny rezistentních nodulačních oddílů, ABC nebo hlavních facilitátorů (obr. 2, A až C). Transmembránové šroubovice TM1-TM6 a TM7-TM12 lze superponovat se střední kvadratickou odchylkou (RMSD) 3,4 Å na 176 zbytcích (obr. 2D). Vnitřní pseudosymetrie podporuje hypotézu, že savčí membránové AC vznikly genovou duplikací z jednoduchého systému, pravděpodobně podobného systému „polocyklázy“ Cya/Rv1625c z Mycobacterium tuberculosis (12). Rozhraní mezi oběma polovinami TM AC9 tvoří šroubovice TM1, TM4 a TM6 v N-koncové „polovině“ svazku TM domén a TM7, TM10 a TM12 v C-koncové části proteinu (obr. 2, B a C). Klonování prvního savčího genu AC bylo doprovázeno domněnkou, že AC mohou na základě své primární sekvence fungovat jako transportéry (9). Naše struktura neodhaluje žádnou zjevnou předpokládanou cestu translokace rozpuštěných látek v rámci svazku TM domén, přičemž TM šroubovice AC9 jsou zabaleny těsně vedle sebe. Ačkoli digitoninová micela pravděpodobně poskytuje prostředí podobné prostředí lipidové dvojvrstvy, je možné, že konformace TM šroubovic ve fyziologickém prostředí membrány je odlišná.

Šroubovice TM6 a TM12 AC9 zasahují do cytosolu a tvoří 40 reziduí dlouhé HD označované zde jako HD1 (včetně šroubovic h1.1 a h2.1) a HD2 (šroubovice h2.1 a h2.2; obr. 2, E a F). Tato oblast je důležitá pro funkci AC a guanylylcykláz u prokaryot a eukaryot (12). Zbytky Leu323 až Met333 šroubovice h1.1 a Ile1022 až Leu1032 šroubovice h2.1 tvoří klasickou stočenou spirálu (obr. 2F). Již dříve jsme popsali HD Cya, membránového AC z Mycobacterium intracellulare, který je homologní s Rv1625c z M. tuberculosis (12). HD AC9 vykazuje oproti Cya určité rozdíly v relativním uspořádání jádrové oblasti na hranici s katalytickou doménou (obr. 2, E a F, a obr. S7, A a B). U M. intracellulare Cya jsou krátké šroubovice pevně vázány na C terminálu stočené spirály (obr. S7B). Naproti tomu se vinutá spirála AC9 odvíjí na C-koncích h1.1 a h2.1 (obr. 2F, obr. S7B a obr. S8A). Tato oblast enzymu je kritická pro funkci AC a guanylylcykláz. Genetické mutace spojené s onemocněním mapují HD AC5 u familiární dyskineze a obličejové myokymie (22, 23) a mutace retinální guanylylcyklázy (retGC1) u Leberovy kongenitální amaurózy-1 (24) a dystrofie čípku 6 (CORD6) (25). Nyní můžeme upřesnit pozice mutací spojených s onemocněním pomocí struktury hovězí AC9, která je ve srovnání s M. intracellulare Cya mnohem bližší lidským nukleotidylcyklázám spojeným s patologií.

Funkce svazku 12-TM v savčích AC byla nejasná. Nedávné studie u mykobakteriálního Rv1625c naznačily možnou receptorovou funkci membránou se rozprostírající oblasti mykobakteriálního homologu (12). Části extracelulárního povrchu AC9 se nám nepodařilo rozlišit (obr. 2, A a B) a není jasné, zda se v membránově vázané části proteinu nacházejí funkčně relevantní vazebná místa pro hypotetické ligandy. Podobně se v naší rekonstrukci nepodařilo rozlišit doménu C1b, která spojuje katalytickou doménu C1a s TM7 (obr. S6, E až G). Naše struktura však poskytuje vodítka k tomu, jak by interakce s membránu rozprostírající oblastí mohly ovlivnit katalytickou funkci proteinu. Šroubovice TM6 a TM12 jsou kontinuální s h1.1 a h2.1 v HD. TM6 a TM12 se nacházejí na rozhraní šroubovicových svazků TM1-TM6 a TM7-TM12 a jsou laterálně vystaveny lipidové dvojvrstvě (obr. 2E a obr. S8B). Lze předpokládat, že přímé interakce TM6 nebo TM12 s lipidy, malými molekulami nebo jinými proteiny by mohly přímo ovlivňovat katalytickou doménu změnou orientace šroubovic h1.1 a h2.1 (obr. S8B).

Kompletní katalytická doména AC9 se skládá ze dvou polovin, C1a a C2a (obr. 1E a 3A), podobně jako dříve vyřešené rentgenové struktury rozpustných domén membránových AC (obr. S7, A a C). Jak bylo ukázáno dříve, hlavní interakční rozhraní mezi podjednotkou α proteinu G a katalytickou doménou AC9 je tvořeno zasunutím šroubovice Gαs Switch II do drážky tvořené šroubovicemi α′2 a α′3 domény AC9 C2a (obr. S7, D až F). Oblast HD h1.2 (zbytky 340 až 360) se nachází v blízkosti interakčního povrchu Gαs (obr. S7E). Tato oblast proteinu se zdá být velmi dynamická a nepodařilo se nám vyřešit zbytky spojující His361 a Pro384 AC9 (obr. S7E). Nicméně blízkost této oblasti k rozhraní G protein-AC naznačuje, že tento prvek struktury AC9 pravděpodobně přispívá k interakci mezi AC9 a Gαs.

Byl zjištěn prvek se silnou hustotou, který se nachází uvnitř vazebného místa pro ATP a místa pro forskolin (obr. 3, A a B, a obr. S9, A až C). Tato hustota vykazovala povrchovou podobnost s hustotou MANT-GTP, ale neodpovídala jejímu očekávanému umístění (obr. 3A). Zdálo se, že hustota v místě forskolinu se překrývá s očekávanou polohou forskolinu (obr. 3A). Podobný rys hustoty byl přítomen v mapě rekonstruované ze snímků vzorku zbaveného forskolinu (obr. 3B a obr. S9B). Nezávisle na přítomnosti MANT-GTP a/nebo forskolinu se tedy zdá, že aktivní a alosterická místa jsou obsazena hustotou odpovídající peptidu (obr. 3, A a B, a obr. S9, A a B). Zaměřená 3D klasifikace a zpřesnění odhalily souvislost mezi touto hustotou a C-koncovou oblastí C2a domény AC9 (obr. 3C a obr. S3 a S9C). Ačkoli rysy hustoty v této méně zalidněné 3D třídě (mapa SOL-C, vypočtená pouze s 16 343 částicemi) nejsou dostatečně silné, aby bylo možné s jistotou sestavit atomární model proteinu, pomocí dostupné hustoty jako omezení jsme ji mohli přiřadit ke zbytkům Cys1246 až Pro1275 C-konce AC9 neboli domény C2b (obr. 3C a obr. S9C). Vysoká kvalita hustoty uvnitř alosterického a aktivního místa (obr. 3A a obr. S9, A a D) nám umožnila sestavit model okluzního peptidu, který odpovídá zbytkům Ile1263 až Pro1275 domény C2b AC9 (obr. S9D). Tato oblast je vysoce konzervovaná mezi obratlovčími homology AC9 (obr. S9E), ale ne u ostatních izoforem AC (AC1 až AC8) (obr. S10).

Pro určení funkční role domény C2b v AC9 jsme porovnali enzymatické vlastnosti divokého typu a zkráceného proteinu zbaveného domény C2b AC91250 (obr. 3D a obr. S11A). Oba konstrukty vykazovaly srovnatelnou schopnost přeměny ATP na cAMP s podobnými hodnotami Michaelisovy konstanty (Km) a Vmax (obr. 3E a tab. S2). AC91250 byl aktivován forskolinem a inhibován MANT-GTP podobně jako AC9 (obr. S11, B až D). Přidání Gαs silně stimulovalo produkci cAMP AC9 (obr. 3F) se současným zvýšením jeho Km pro ATP. V souladu s ocáskem inhibujícím vazbu ATP vykazoval AC91250 vysokou Vmax, ale při mnohem nižší hodnotě Km (obr. 3F). To je silným důkazem, že oblast C2b hraje funkční roli ve stavu vazby AC9 na G protein. Odstranění oblasti C2b zvyšuje afinitu AC9 k ATP v přítomnosti Gαs, což umožňuje proteinu dosáhnout maximální rychlosti katalýzy při mnohem nižších koncentracích ATP. Snížení afinity k substrátu (ATP) okluzí aktivního místa doménou C2b může představovat regulační mechanismus pro řízení produkce cAMP AC9 vázaným na G protein.

Pro posouzení konformačních změn v okludovaném stavu AC9 jsme stanovili kryoEM strukturu komplexu AC91250-Gαs v přítomnosti MANT-GTP a forskolinu (AC91250-Gαs-MF; obr. 3, G a H, a obr. S12 a S13). Rekonstrukce s rozlišením 4,2Å nám umožnila jasně rozlišit hustotu pro MANT-GTP a forskolin vázané v jejich kanonických vazebných místech (obr. 3, G a H, a 4; obr. S13, E až G). Porovnání uspořádání katalytických domén komplexů AC91250-Gαs-MF a AC9-Gas odhalilo malé relativní přeskupení C1a závislé na přítomnosti okludujícího peptidu v aktivním a alosterickém místě (obr. 4, A a B); RMSD mezi atomy pohyblivých domén C1a (Ile1380 až Gln574) obou srovnávaných struktur zarovnaných pomocí jejich domén C2a (Gln1049 až Lys1245) je 1,9 Å. Jemný pohyb celých domén pozorovaný v okludovaném stavu AC9 posouvá aminokyselinové zbytky C1a zapojené do vazby nukleotidu o ~3 Å (obr. S13H). Jádro katalytické domény AC9 tedy zaujímá okludovanou konformaci, přičemž peptid odvozený od C2b zabírá aktivní a alosterické místo proteinu (obr. S9, D a E) současně s narušením aktivního místa ve srovnání se stavem pozorovaným ve stavu vázaném na MANT-GTP a forskolin.

Struktura komplexu AC9-Gαs v okludované konformaci nám umožnila přehodnotit zavedený model přenosu signálu na bázi cAMP (7, 26) (obr. S14). Aktivace kaskády GPCR musí vést k vytvoření formy AC vázané na podjednotku Gαs, aby se generoval cAMP. Zde popsaný okludovaný stav však přidává mezistupeň, který dosud nebyl doceněn. Okludovaný stav a aktivní stav AC9 pravděpodobně existují v rovnováze; vzorek, který vytvořil rekonstrukci okludovaného stavu, může být aktivován G proteinem a může produkovat cAMP. Výrazně snížená Km proteinu pro ATP (obr. 3F) dále naznačuje, že okluze místa pro ATP může být v přítomnosti G proteinu zvýhodněna. Budoucí experimenty pomohou definovat funkční roli této konformace proteinu v katalytickém cyklu AC9.

Architektura AC9 odhalená v této studii poskytuje vodítko k možné roli membránových částí v savčích AC. Jednou ze zjevných funkcí membránové domény je umožnit správné sestavení aktivní cyklázy. Toho je dosaženo tím, že TM6 a TM12 poskytují rámec pro HD. Je pravděpodobné, že prvky proteinu, které v současné době nelze rozlišit, tj. terminus N a doména C1b, přispívají k sestavení a regulaci funkce cyklázy AC9 (obr. S6, E až G). Je tedy možné, že navzdory oddělení katalytické domény o ~40 Å od lipidové dvojvrstvy může membránová část proteinu ovlivňovat katalytickou doménu prostřednictvím HD a oblastí smyček, které k ní přiléhají.

Zakrytý stav komplexu s C-terminálním peptidem, který váže jak aktivní, tak alosterické místo AC9, může představovat důležitý autoregulační mechanismus zabudovaný do mechanismu přenosu signálu na bázi AC. Přítomnost peptidu může pomoci vysvětlit rozporuplná pozorování necitlivosti AC9 na forskolin (14, 19, 20), což podporuje autoregulaci AC9 závislou na kontextu. Forskolin je rostlinný malomolekulární aktivátor AC; předpokládá se, že přirozený aktivátor nebo inhibitor tohoto místa v AC existuje (20), ale dosud nebyl identifikován. V případě AC9 můžeme nyní ukázat, že (i) forskolin je schopen aktivovat enzym a (ii) pravděpodobným přirozeným regulátorem alosterického místa je část domény C2b vázaná na aktivní oblast proteinu. Předpokládáme, že po aktivaci proteinem G (obr. S14, A až D) C2b okluduje reakční centrum AC9 a blokuje enzymatickou aktivitu, čímž zabraňuje nadměrné produkci cAMP v buňce (obr. S14E). To je v souladu s nedávnou zprávou o autoinhibiční funkci domény C2b AC9 v buněčném kontextu (27). Naše zjištění mohou pomoci vydláždit cestu k vytvoření nových přístupů při objevování léčiv, které využívají autoregulační molekulární mechanismus odhalený strukturou AC9-Gαs.

.