TEXT
Lidské chřipkové viry obvykle infikují horní cesty dýchací a způsobují kýchání, rýmu a kašel, ale také horečku, malátnost a artralgie (22). Kromě toho byly při zavlečení nového podtypu chřipkového viru do lidské populace hlášeny také neurologické komplikace, jak je příkladem španělská (1918) a asijská (1957) pandemie (2-4, 6, 10, 18, 22).
V roce 1997 způsobil virus chřipky H5N1, který pocházel od drůbeže, epidemii u lidí. Od té doby se virem H5N1 nakazilo na celém světě více než 500 lidí, přičemž úmrtnost činila přibližně 60 % (21). Infekce virem H5N1 u lidí se obvykle projevuje těžkým zápalem plic, který přechází v syndrom akutní respirační tísně; u některých obětí viru H5N1 však došlo k neurologickému postižení (1). RNA a antigeny viru H5N1 byly zjištěny v mozku pacientů a samotný virus byl izolován z mozkomíšního moku (5, 7) Tyto údaje naznačují, že některé viry H5N1 by mohly u lidí způsobit encefalitidu, jak se stalo v počátečních fázích španělské a asijské pandemie.
Ferety představují užitečný savčí model chřipkové infekce, protože jsou vysoce vnímavé k infekci chřipkovými viry a objevují se u nich některé příznaky chřipky, které se projevují u lidí (8, 12, 14, 16, 19). Neuroinvazivita viru chřipky H5N1 po intranazální expozici byla rovněž zaznamenána na modelu fretky (23). Proto jsme za účelem studia dlouhodobých neurologických účinků infekce virem H5N1 infikovali fretky viry H5N1, které u těchto zvířat vyvolávají mírné příznaky, a po dobu 9 měsíců jsme sledovali účinky na centrální nervový systém (CNS). Snažili jsme se také objasnit cestu, kterou tyto viry H5N1 pronikají do CNS.
Šestiměsíční fretky byly intranazálně inokulovány 106 PFU viru A/Hong Kong/483/1997 (H5N1; HK483) nebo A/Hong Kong/486/1997 (H5N1; HK486). Tyto viry byly množeny v buňkách Madin-Darbyho psích ledvin (MDCK) v minimálním esenciálním médiu doplněném 0,3 % hovězího sérového albuminu. Ve dnech 3, 6 a 12 a v měsících 1, 3, 6 a 9 po infekci (p.i.) jsme odebrali vzorky tkáně pro izolaci viru a patologické vyšetření. Fretky byly během prvních 10 dnů p.i. letargické a vykazovaly známky a příznaky respirační infekce, ale postrádaly znatelné neurologické příznaky, což je v rozporu s dříve uvedenými výsledky (23). Vzorky tkání z nosních turbinátů, plic, průdušnice, mozku, jater, sleziny, ledvin, srdce, slinivky břišní a míchy byly odebrány a homogenizovány na 10% suspenzi s fosfátovým roztokem. Titr viru v každé tkáni byl stanoven pomocí plakových testů. Viry se replikovaly především v nosních turbinátách, přičemž titry virů dosahovaly 105 až 106 PFU/gram tkáně po 3 až 6 dnech p.i. (tabulka 1). Mozkové tkáně odebrané fretkám infikovaným HK483 nebo HK486 byly konzervovány v 10% neutrálním pufrovaném formalínu a zpracovány pro zalití do parafínu. Tkáně vložené do parafínu byly nakrájeny na 5 mm silné řezy a obarveny hematoxylinem a eosinem (H&E). Další řezy byly nařezány pro imunohistologické barvení králičími polyklonálními protilátkami proti viru chřipky H5. Histologické vyšetření odhalilo invazi nebo poškození neuronů včetně zánětu cévnatkového plexu (tabulka 2). Fretky infikované virem HK486 vykazovaly známky nesupurativního zánětu (obr. 1a) a expresi virového antigenu (obr. 1b), která přetrvávala 12 dní; virové antigeny nebyly zjištěny po 1 měsíci p.i. Nesupurativní encefalitida trvala 3 měsíce (obr. 1c), přičemž reziduální gliové jizvy byly patrné po 6 a 9 měsících p.i. v oblastech, kde byly v předchozí fázi zjištěny virové antigeny (obr. 1d). Dále fretky infikované HK486 vykazovaly makroskopické poškození čichového systému ve 12. dni p.i. (obr. 1e a f). Tato zjištění naznačují, že ačkoli vysoce patogenní viry H5N1 postihují především dýchací cesty hostitele (1), mohou způsobovat i neurologické komplikace. Na rozdíl od viru HK486, který napadl mozkový parenchym fretek a způsobil těžké parenchymové poškození, druhý kmen H5N1, HK483, způsobil těžkou nesupurativní vaskulitidu bez zjevného parenchymového poškození mozku fretek v 6 dnech p.i.. Ačkoli nebylo možné detekovat virový antigen ve vaskulatuře, bylo zřejmé poškození cév, charakterizované zduřením endotelu (obr. 2a, hroty šipek), roztroušenými apoptotickými buňkami (obr. 2b, hroty šipek) a intramurální infiltrací makrofágy (obr. 2a, šipky) a polymorfonukleárními leukocyty (obr. 2b, šipka). Cévní léze byly nalezeny v talamu, na rozhraní šedé a bílé hmoty a v mozkovém kmeni. Vzorky mozku vyšetřené po 1 a 6 měsících p.i. vykazovaly hemoragické léze svědčící o chronickém a opakovaném perivaskulárním krvácení (obr. 2c) v thalamu, mozečku a subarachnoidálním prostoru předního mozku (obr. 2d). Tato pozorování jsou v souladu se zprávami o hemoragických mozkových komplikacích vyvolaných virem chřipky během každoročních epidemií (11). Mozková vaskulitida sekundární k virové infekci je poměrně častá (17) a je pravděpodobně příčinou křehkosti cévní stěny, která vede ke krvácení do mozku. Zdá se proto rozumné dojít k závěru, že infekce virem H5N1 u lidí může způsobit krvácení do mozku podobné tomu, které je pozorováno při infekci jinými neurotropními viry.
- Zobrazit inline
- Zobrazit vyskakovací okno
Využití viru z tkání fretek infikovaných virem HK483 nebo HK486 H5N1
- View inline
- View popup
Prevalence mozkových lézí u fretek v různých časových bodech po infekci vysoce patogenním virem chřipky H5N1a
Mozkové léze u fretek infikovaných virem HK486. (a) Těžká nesupresivní encefalitida v čichové oblasti 6. den po infekci (p.i.). (b) Exprese virového antigenu v mozkové lézi v den 12 p.i. Neuronální a gliové buňky jsou obarveny antisérem proti viru H5. (Vložka) Neinfikované neurony a glie. (c) Doutnající encefalitida v mozkové tkáni ve 3 měsících p.i. (d) Tvorba perivaskulární gliové jizvy v 9 měsících p.i. (e) Makroskopicky viditelná mozková léze v části čichového systému (piriformní lalok) ve 12. dni p.i. (f) Částečná ztráta čichového bulbu (horní strana mozku ) v důsledku virové encefalitidy v 1 měsíci p.i. Srovnejte tyto snímky s mozkem věkově odpovídající kontroly (dolní část mozku).
Mozkové léze u fretek infikovaných virem HK483. (a) Výrazná nesupurativní vaskulitida v den 6 p.i. Všimněte si silného zduření cévní endotelové buňky (šipky) a migrace makrofágů do cévní stěny (šipky) ve srovnání s normálním vzhledem okolního mozkového parenchymu. (b) Roztroušené apoptotické buňky (hroty šipek) a polymorfonukleární leukocyty (šipka) v cévní stěně v den 6 p.i. (c) Staré a čerstvé hemoragické léze v thalamu fretky, která byla podrobena nekropsii v 6 měsících p.i. (hroty šipek, makrofágy s hemosiderinem ve staré lézi; šipky, čerstvé krvácení s červenými krvinkami). (d) Čerstvé subarachnoidální krvácení v mozku fretky v 6 měsících p.i. Všimněte si nahromadění červených krvinek mezi leptomeningy (černá přerušovaná čára) a arachnoideou (červená přerušovaná čára).
Pro zkoumání cesty, kterou viry H5N1 pronikají do mozku fretek, jsme analyzovali distribuci mozkových lézí a expresi virového antigenu pozorovanou u fretek infikovaných viry HK483, HK486, A/Hong Kong/213/2003 (HK213), A/Vietnam/1204/2004 (VN1204) a A/duck/Vietnam/NCVD-18/2004 (NCVD18). Viry HK213, VN1204 a NCVD18 byly množeny v buňkách MDCK v minimálním esenciálním médiu doplněném 0,3 % bovinního sérového albuminu. Šestiměsíčním fretkám bylo intranazálně inokulováno 106 PFU viru. Mozková tkáň byla odebrána v akutní fázi, 3 a 6 dní po infekci pro VN1204 a NCVD18 a dodatečně 12 dní po infekci pro HK213. Tkáně byly zpracovány pro barvení H&E a imunohistochemii pro histologické vyšetření. Léze mozkového parenchymu vyvolané VN1204, NCVD18 a HK213 byly charakterizovány nesupurativní encefalitidou a vzorec exprese virových antigenů byl v podstatě stejný jako u HK486 (údaje nejsou uvedeny). Abychom pochopili trojrozměrné (3D) rozložení mozkových lézí a virových antigenů, vykreslili jsme je pomocí 3D zobrazení (TRI/3D-SRF2; Ratoc System Engineering Co., Ltd., Japonsko) mozku mangusty žluté (Cynictis penicillata), jehož architektura se velmi podobá mozku fretky (20). Pro vizualizaci čichové dráhy (tj. smyslové dráhy pro čich) jsme na 3D snímcích jako referenční rámec označili nervové dráhy z čichového bulbu do piriformní kůry (obr. 3a, žlutě; viz také film S1 v doplňkovém materiálu). Zjistili jsme tři odlišné vzorce mozkových lézí, s virovými antigeny i bez nich, způsobených různými viry chřipky H5N1: léze rozmístěné pouze podél čichové dráhy (obr. 3b a c, přerušovaná žlutá čára; viz také filmy S2 a S3) (HK213 a NCVD18); léze detekované podél čichové dráhy (obr. 3d a e, přerušovaná žlutá čára; viz také filmy S4 a S5) a v mozkovém kmeni (obr. 3d a e, bílé šipky; viz také filmy S4 a S5) (HK486 a VN1204); a ty v jiných oblastech (obr. 3f; viz také film S6) (HK483). Základ pro oddělení třetí skupiny lézí od ostatních dvou skupin je zřejmější, když se rozložení lézí zkoumá ze zadní strany (obr. 3g a h, žlutá versus modrá versus červená). Tyto výsledky mapování naznačují, že většina námi testovaných kmenů H5N1 pronikla do mozku čichovou cestou (obr. 3, přerušovaná žlutá čára). Jednou z výjimek byl kmen HK483 (obr. 3f), který se u fretek zjevně zaměřil na mozkové cévy a vyvolal léze mimo čichový systém
Distribuce mozkových lézí po infekci kmeny HK483, HK486, HK213, NCVD18 nebo VN1204 viru H5N1. Mozkové léze jsou zmapovány na trojrozměrných snímcích mozku žluté mangusty. Analyzovány byly vybrané části mozkových řezů, proto jsou grafy umístění lézí nespojité. (a) Čichová cesta (žlutá). Distribuce lézí a virových antigenů (červená) spojených s infekcí HK213 (b) nebo NCVD18 (c) sleduje čichovou cestu (přerušovaná žlutá čára). U zvířat infikovaných HK486 (d) nebo VN1204 (e) se léze a virové antigeny nacházejí v mozkovém kmeni (bílé šipky) a čichovou cestou (červené čárky uvnitř přerušované žluté čáry). Kmen HK483 (f) způsobil závažné poškození cév se zjevnými hemoragickými lézemi (modré plošky). (g) Zadní pohled na čichovou cestu (žluté čárky). (h) Zadní pohled na hemoragické léze vyvolané HK483 (modré) a vaskulitidu (červené) mimo čichovou cestu. Panely a až f jsou ventrální pohledy.
Než se viry H5N1 stanou pandemickými, budou pravděpodobně muset získat schopnost dobře růst v horní části dýchacích cest člověka, což by vedlo k účinnému přenosu z člověka na člověka kýcháním a kašláním (13, 22). Naše údaje od fretek naznačují, že pokud vysoce patogenní viry H5N1 získají tuto pozici u lidí, mohly by způsobit subklinické neurologické komplikace tím, že by napadly mozek cestami nervových drah nebo způsobily mozkovou vaskulitidu. Již dříve byl v mozku fretky zjištěn virus H3N2; množství viru v mozku však bylo nízké (méně než 102,2 log10 50% infekčních dávek z vajíčka) a v mozku nebyly prokázány žádné antigeny viru (23). Zjistili jsme, že pandemický virus H1N1 z roku 2009 se v dýchacích cestách fretek replikoval účinněji než lidský sezónní virus H1N1 (9, 13, 15) a způsobil nesupurativní léze čichového bulbu; virus jsme však v mozkovém parenchymu těchto zvířat nenašli (údaje nejsou uvedeny). Invaze do mozkového parenchymu, prokázaná přítomností virových antigenů, je tedy charakteristická pro viry H5N1. Bylo by proto vhodné provést retrospektivní a prospektivní studie subklinických neurologických komplikací u pacientů infikovaných virem H5N1. Naše zjištění vyvolávají obavy, že by subklinické neurologické komplikace mohly doprovázet závažné respirační infekce při celosvětovém rozšíření virů H5N1.
.