Transcriptomic analysis of grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus) using 454 pyrosequencing: comparison with A. tuberculatus, profilování exprese ve stoncích a v reakci na biotický a abiotický stres

Roche GS-FLX a GS-FLXTM sekvenování a sestavování

Šest běhů sekvenování poskytlo ≈910 Mb celkové velikosti dat odpovídající 2 913 966 surovým čtením. Soubory surových sekvencí jsou k dispozici v archivu sekvenčních čtení NCBI (SRA) na adrese http://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?study=SRP006173 jako soubory SRR172675 (S1), SRR172676 a SRR183482 (S2), SRR172677 (S3), SRR172678 a SRR183483 (S4), SRR172679 (S5) a SRR172680 (S6). Rozložení délkových frekvencí surových čtení se shlukovalo kolem rozmezí 200 až 300 bp a 300 až 400 bp v důsledku použití dvou různých platforem pro sekvenování (obr. 1A). Do procesu sestavování vstoupilo celkem 2 700 168 čtení (93 % z celkového počtu), která poskytla 21 207 vysoce kvalitních sestavených sekvencí (20 408 izotigů + 799 kontigů¸ což odpovídá 87 % čtení vstupujících do sestavování a ≈82 % všech sestavených sekvencí). Jejich délka se pohybovala od 80 do 3 379 bp (obrázek 1B) a měly průměrnou délku sekvence 1 014 bp (izotigy) a 930 bp (kontigy). Celkem 178 636 čtení (≈6 % z celkového počtu) zůstalo jako singletony (hloubka pokrytí = 1); z nich po kontrole kvality zůstalo pouze 5 113 čistých sekvencí. Izotigy byly dále začleněny do 15 667 izoskupin. Shrnutí stavu procesu sekvenování, sestavování a anotace (viz níže) je uvedeno v tabulce 1.

Anotace kontigů/izotigů A. hypochondriacus

Všechny kontigy/izotigy byly dotazovány na č., TAIR, UniRef100, UniRef50 a databáze EST Amaranthaceae a PFAM pro anotaci. Přibližně 82 % všech záznamů poskytlo významné shody (E ≤ 1 × 10-10) při dotazování na databázi nr (tabulka 1). 3 901 sekvencí, u nichž nebyl nalezen žádný významný zásah proti databázi nr, bylo dotazováno proti databázi proteinových domén PFAM s cílem určit jejich předpokládanou funkci. Pouze malá část těchto sekvencí (≈2 %) poskytla významné shody (hodnoty E ≤ 1 × 10-5) se známými proteinovými doménami. Tyto výsledky jsou k dispozici v doplňkovém souboru 1. Anotace 5 113 čistých singletonů proti databázi TAIR poskytla přibližně 1 000 významných shod.

Nejlepší shoda pro každý unigen dotazovaný proti databázi TAIR byla využita k přiřazení funkční anotace GO z hlediska skupin biologických procesů (11 224 sekvencí), molekulárních funkcí (11 499 sekvencí) a buněčných komponent (11 227 sekvencí). Výsledky jsou shrnuty na obrázku 2. Podle očekávání největšímu procentu v každé skupině GO (12 % až 15 %) odpovídaly kontigy/izotigy s neznámou funkční anotací. Mezi amaranthem obilným a Arabidopsis thaliana nebyly pozorovány žádné zjevné rozdíly v počtu sekvencí přiřazených do jednotlivých kategorií, včetně reakce na (a)biotický stres. To bylo pravděpodobně odrazem známé schopnosti Arabidopsis silně reagovat na abiotické a biotické stresy na transkripční úrovni . Tento výsledek také svědčí proti možnosti, že amarant zrnový má odlišný transkriptomický podpis, zejména v kategoriích stresu a reakce na podněty, který by mohl vysvětlit jeho charakteristickou toleranci k (a)biotickému stresu, na rozdíl od toho, co bylo pozorováno u rostlinných druhů adaptovaných na extrémní stanoviště (např. halofyt Thellungiella halophila příbuzný Arabidopsis a extrémofilní mangrovy ). Funkční přiřazení GO pro biologické procesy (obr. 2A) tedy ukázalo, že 3 % kontigů/izotigů byla zařazena do skupiny reakce na stres/stimuly, 2 % do vývojových procesů a další 4 % do ostatních biologických a metabolických procesů. Tyto kategorie nás zajímaly zejména vzhledem k tomu, že jedním z primárních cílů této transkriptomové studie bylo poskytnout informace vedoucí k identifikaci genů reagujících na (a)biotický stres (viz níže). Z počtu transkriptů, kterým byla přiřazena obranná role (1 % z celkového počtu), byla více než polovina spojena s bakteriální infekcí (41 %) a regulací kyseliny jasmonové (JA) (24 %), včetně mnoha biosyntetických genů JA (např. LOX13, AOS, AOC, OPR3) a genů reagujících na JA (Obrázek 3A; viz také doplňkové soubory 2, 3 a 4).

Celkový pohled získaný z výše uvedených informací je, že amarant zrnový disponuje rozmanitým arzenálem genů pro odolnost vůči infekci patogeny a herbivornímu hmyzu, z nichž většina je u tohoto druhu uváděna poprvé. Patří mezi ně geny potenciálně zapojené do syntézy oxalátů a fytoekdysteroidů (výsledky nejsou uvedeny), které jsou u amarantu a dalších druhů považovány za účinné obranné zbraně . Uplatnění poměrně robustní obranné reakce bylo poněkud neočekávané, přinejmenším proti herbivornímu hmyzu, vzhledem k tomu, že by se dalo očekávat, že neobvykle vysoká tolerance k defoliaci, kterou jsme pozorovali u rostlin A. hypochondriacus (viz níže), tento druh osvobodí od investic do metabolicky nákladných indukovatelných obranných reakcí (např. inhibitorů proteáz a lektinů). Povaha izolovaných genů odolných vůči patogenům byla rovněž komplexní a zahrnovala celou škálu bakteriálních a houbových proteinů indukovaných elicitory a souvisejících s patogenezí, extracelulární receptory podobné těm, které se podílejí na obranných reakcích indukovaných elicitory, proteázy, transkripční faktory (TF) a enzymy zapojené do tvorby a detoxikace reaktivních forem kyslíku.

Důležité z našeho pohledu byly také geny potenciálně zapojené do kompenzační fotosyntézy, relokalizace sacharidů (tabulka 2) a regulace/syntézy hladin fytohormonů (obrázek 3B), což pravděpodobně souvisí se zvýšeným větvením pozorovaným u rostlin amarantu obilného jako reakce na defoliaci způsobenou herbivory hmyzu a/nebo mechanickým poškozením . Mnohé z identifikovaných genů lze využít ke studiu nesouvisejících procesů. Například analýza genů souvisejících s fytohormony v kombinaci s těmi, které vykazují homologii s geny kvetení, je prováděna s cílem získat přehled o genetických mechanismech zodpovědných za několik symptomů vyvolaných infekcí fytoplazmou amarantu obilného na poli, včetně fylodie .

Srovnání transkriptomu A. hypochondriacus a A. tuberculatus

Veřejně dostupná surová transkriptomická 454 pyrosekvenační data získaná pro A. tuberculatus byla znovu sestavena pomocí stejných výpočetních metod jako pro A. hypochondriacus. V našich rukou však sestavení poskytlo poměr kontigů/singletonů (12 216/53 803), který se lišil od poměru uváděného prvními pracovníky (22 035/22 434), možná v důsledku použití různých assemblerů . Rozdíl se vyskytl navzdory skutečnosti, že 83 % z celkového počtu surových čtení A. tuberculatus vstupujících do procesu bylo sestaveno. Zarovnání BLASTN výsledných 12 216 kontigů A. tuberculatus s 21 207 izotigy/kontigy A. hypochondriacus poskytlo 8 260 homologických sekvencí (E ≤ 1 × 10-10 a ≥ 90 % identity). Počet kontigů od každého druhu, které poskytly významné shody (E ≤ 1 × 10-10) při dotazování na databáze Uniref 100 a Amaranthaceae ESTs, je uveden v tabulce 3. Kombinované využití výše uvedených informací vedlo ke kvantifikaci počtu homologických kontigů poskytujících stejnou shodu, různé shody, jednu shodu pro jeden druh a žádnou pro druhý a naopak a žádnou shodu. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 4. Analýza homologních transkriptů anotovaných v databázi EST Amaranthaceae ukázala, že většina z nich má neznámou funkci/původ (21 %). Nejvyšší podíl (71 %) byl nalezen v knihovnách EST vytvořených z nezralých semen a květních pletiv u Chenopodium quinoa, květenství, klíčícího pletiva, kořenů v různých stádiích vývoje, hypokotylu, stonků semen a kotyledonů kořene řepy a buněk chlorenchymu ne-Kranzova C4 druhu Bienertia sinuspersici. Geny související se stresem tvořily nejmenší část (8 %), většinou zastoupenou EST generovanými z halofytních druhů vystavených solnému stresu (Salicornia brachiata, Suaeda salsa, S. maritima, Atriplex centralasiatica a C. glaucum, kromě EST z nezralého pletiva Salsola tragus. Všechny identifikované transkripty související s biotickým stresem pocházejí z knihoven cDNA z kořenů řepy vystavených žíru larvy (Tetanops myopaeformis) . Na druhé straně dvě třetiny homologních transkriptů anotovaných v databázi Uniref100 měly neznámou funkci. Následná klasifikace transkriptů (33 %) s přiřazenou funkcí v kategorii biologických procesů zařadila většinu z nich (16 %) do skupiny zahrnující základní house-keepingové funkce (např. organizace a biogeneze buněčných složek, buněčný cyklus, buněčná smrt, regulace genové exprese, translace, buněčná homeostáza, morfogeneze a růst anatomických struktur, metabolické procesy sacharidů, proteinů a DNA, transport a fotosyntéza), primární a sekundární metabolismus (7 %), transdukce signálu a regulace transkripce (4 %). Zbytek zahrnoval transkripty exprimované v reakci na biotický (2 %) a abiotický stres (4 %). Většina z nich byla izolována z Amaranthaceae a příbuzných halofytů většinou vystavených solnému stresu, Zajímavé geny související s (a)biotickým stresem přítomné u obou druhů zahrnují protein spojený s plastidem a lipidem, o němž je známo, že je indukován v reakci na více stresů u mnoha rostlinných druhů , AtPOB1, protein s doménou BTB/POZ, který pozitivně reguluje reakce na choroby u Arabidopsis a tabáku , protein AtPP2-A1, jehož nadměrná exprese u Arabidopsis silně potlačila žír floému mšice broskvoňové Myzus persicae, transkript podobný nespecifickému lipid-transfer proteinu typu 2 z Tamarix hispida, jehož exprese byla u tohoto druhu shledána jako součást adaptivní reakce na abiotické stresy , polyaminoxidáza, enzym produkující H2O2, který se údajně podílí na procesech diferenciace buněčné stěny a obranných reakcích a o němž bylo nedávno zjištěno, že je nutný pro hojení ran u kukuřice , methionin sulfoxid reduktasa, o níž se zjistilo, že je aktivní v obraně proti patogenům u rostlin papriky prostřednictvím regulace buněčného redoxního stavu , a DEAD-box ATP-dependentní RNA helikáza 7, typ opravného proteinu DNA, u něhož se nedávno ukázalo, že při expresi v rostlinách propůjčuje odolnost vůči více stresům . Pozoruhodná byla také identifikace několika genů souvisejících s homeostázou a tolerancí iontů těžkých kovů, detoxikací kationtů, transportem vody a biosyntézou a přenosem signálů souvisejících se stresem u fytohormonů (např. kyseliny abscisové a JA) (viz doplňkový soubor 5).

Počet anotovaných transkriptů, které byly zjištěny pouze u jednoho druhu, byl poměrně velký (tab. 5). Názorný příklad rozdílů pozorovaných mezi transkriptomy plevelného amarantu a amarantu obilného poskytuje analýza genů cílených na herbicidy, které byly anotovány pomocí databází UniRef 100 a Amaranthaceae ESTs. Z ní vyplynulo, že 29 z nich bylo nalezeno u obou druhů, zatímco 13 a 8 sekvencí bylo nalezeno pouze u A. hypochondriacus a A. tuberculatus (tab. 6).

Poměrně přísné parametry použité pro srovnání transkriptomů mohly vést ke zde pozorovaným rozdílům v transkriptomech, i když použití nižších prahových hodnot E (řekněme E ≤ 1 × 10-5) nemuselo příliš přispět ke zvýšení úrovně homologie transkriptů, jak naznačuje předchozí studie sekvenování genomu u Eucalyptus grandis. Dalším pravděpodobnějším možným vysvětlením však je, že výše uvedené rozdíly byly odrazem zásadních rozdílů v celkovém experimentálním designu použitém k získání obou transkriptomických dat. Například mnoho genů souvisejících s biotickým stresem zjištěných u A. hypochondriacus chybělo u A. tuberculatus (výsledky nejsou uvedeny). Alternativní hypotéza navrhující, že pozorovaný rozdíl byl způsoben důležitou sekvenční divergencí, ke které došlo během speciace/domestikace, bude vyžadovat mnoho dalšího výzkumu, aby byla potvrzena.

Digitální profilování exprese

Stress-responsive transcriptional profile in leaves

Tato technika, známá také jako tag sampling nebo RNA-seq, je považována za účinnou metodu analýzy genové exprese . Analýza digitálního expresního profilu provedená pro A. hypochondriacus identifikovala celkem 1 971 rozdílně exprimovaných genů v reakci na alespoň jedno ze čtyř testovaných stresových ošetření (tj. vodní stres, solný stres, herbivorní hmyz a bakteriální infekce) (Additional file 6). Bylo vytvořeno padesát různých profilů genové exprese, aby bylo možné určit vliv daného stresového ošetření na úroveň exprese určitého genu. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 4. Evidentním rysem této analýzy bylo vysoké procento neanotovaných genů nebo genů s neznámou funkcí, které byly indukovány stresem. Ty představují potenciálně bohatý zdroj genetického materiálu, který by mohl být systematicky analyzován za účelem objevení genů zapojených do nových mechanismů odolnosti vůči stresu.

Všechny stresem indukovatelné geny se známou funkcí, které byly identifikovány ve 41 z 50 kategorií genové exprese, byly rovněž uvedeny v tabulkách (doplňkový soubor 7). Patřilo mezi ně několik TF, o nichž je známo, že jsou regulátory reakcí na stres u jiných druhů rostlin, např. protein podobný AREB , protein obsahující doménu zinkového prstu typu Dof , protein obsahující doménu BTB/POZ , protein obsahující zinkový prst GRF , protein podobný RAP 2.4 , represor JAZ1 , ATEBP/ERF72/RAP2.3 (příbuzný AP2-3) , RAV , transkripční faktor podobný MYB , protein podobný TINY 2 , transkripční faktor se zinkovým prstem Cys2/His2 , málo známý transkripční aktivátor vázající GAGA-motif ; proteiny se zinkovým prstem SCOF-1 , u nichž bylo zjištěno, že jsou indukovány chladovým nebo solným stresem u Arabidopsis a dalších rostlin a zřejmě zvyšují genovou expresi závislou na ABRE , předpokládaný transkripční faktor NAC a histone-fold/TFIID-TAF/NF-Y . Další byly identifikovány u několika xerofytů/halofytů jako možné faktory, které přispívají k jejich schopnosti kolonizovat extrémní stanoviště, např. proteiny vodního kanálu lykopen-syntáza , myo-inositol-1-fosfát-syntáza, cystathionin-gama-syntáza fosfoenolpyruvátkarboxyláza , Na+/H+ antiportér , proteinfosfatáza-2C , Ca2+/H+ antiportér , kalcineurinu B podobný protein , inositolmonofosfatáza a solí indukovaný hydrofilní protein .

Nepřekvapivě bylo zjištěno, že četné transkripty kódující reaktivní lapače kyslíku jsou silně indukovány, mnohé z nich vícenásobným stresem, např. superoxiddismutáza, glutathion S-transferáza Z1, germin-like oxidáza a několik kataláz, peroxidáz a askorbátperoxidáz. Také silná a několikanásobná stresová indukce aspartylové proteázy, různých cysteinových proteáz, subtilisinu podobné proteázy a vakuolárního zpracovatelského enzymu (VPE) podporuje roli protein-recyklačních procesů v reakci na stres, podobně jako to bylo zjištěno během procesu adaptace na stres ze slanosti u extrémofila T. halophila, zatímco exprese expansinů, xyloglukanových endotransglykosyláz, několika podjednotek syntetázy celulózy, proteinů bohatých na glycin, prolin a hydroxyprolin podporuje pozorovanou schopnost upravovat vlastnosti buněčné stěny u mnoha rostlin vystavených stresu . Mnoho z těchto sacharidově aktivních genů bylo také vysoce exprimováno ve stoncích (viz níže).

Zvlášť důležité byly geny vysoce exprimované několika stresovými ošetřeními, které nebyly dříve u amarantu nebo příbuzných halofilních/extrémních rostlin zaznamenány. Ty mají zřejmý potenciál biotechnologického využití a mohly by také přispět k objasnění molekulárních mechanismů vedoucích k odolnosti vůči více stresovým podmínkám. Výběr zahrnuje následující: Drm3, nezbytný pro de novo metylaci DNA v Arabidopsis thaliana, kde se předpokládá, že reguluje procesy umlčování genů ; Enhancer of SOS 3- 1, který kóduje protein lokalizovaný v chloroplastu, který interaguje s kritickými regulátory SOS3 a SOS2 tolerance vůči solnému stresu v Arabidopsis; proteiny YCF3 a HCF101 (high chlorophyll fluorescence 101), které jsou považovány za nezbytné pro sestavení a akumulaci komplexu fotosystému I (PSI) a prevenci fotooxidačního poškození ; translační iniciační faktor eIF1, o němž bylo zjištěno, že je určujícím faktorem tolerance vůči sodíku u kvasinek a rostlin, což naznačuje, že translace je cílem toxicity soli a že její obnovení může být klíčovým mechanismem pro přežití buněk v podmínkách stresu způsobeného NaCl, kromě navrhované regulace akumulace iontů a vnitrobuněčného redoxního stavu ; ATP-dependentní proteáza FtsH 9, která se podílí na degradaci proteinu D1 fotodestrukce (PSII), což je krok, který je nutný k zabránění akumulace nadměrného množství reaktivních forem kyslíku ; přenašeč elektronů ACD1-LIKE, podobný produktu genu pro urychlenou buněčnou smrt Arabidopsis, který se podílí na okysličování feoforbidu a, jenž je nutný k zabránění fotooxidační destrukci buňky a u něhož bylo rovněž zjištěno, že je regulován během procesu adaptace na solný stres u T. halophila; prohibitinový gen PHB1, u jehož členů rodiny bylo zjištěno, že se hromadí v reakci na různé stresové podmínky u mnoha rostlin a pravděpodobně působí jako ochrana funkce a integrity mitochondrií, spouštěče retrográdní signalizace mezi mitochondriemi a jádrem a/nebo mediátory vzájemného působení H2O2 a NO, a to dosud neurčeným mechanismem; protein Yellow Stripe Like 6, o jehož členech se předpokládá, že se podílejí na přenosu kovových mikroživin do cévních tkání a z nich a na toleranci a hyperakumulaci kovů ; předpokládaná spojovací varianta proteinu histonu H1, exprimovaná v podmínkách stresu ze sucha u rajčat a působící jiným mechanismem než uspořádáním chromatinu, který by měl zahrnovat negativní regulaci stomatální vodivosti ; GASA-1/LtCOR1-like, protein regulovaný gibereliny, který se údajně podílí na regulaci zrání plodů nebo nastolení dormantního stavu v kambiálních meristémech stromů ; beta a gama-tubulinové řetězce, jejichž exprese se shoduje se stále důležitější úlohou, kterou hraje cytoskelet při zprostředkování reakce rostlinné buňky na stres ; translační iniciační faktor 5A, u něhož bylo zjištěno, že se podílí na zřejmě izoformně závislé regulaci cest reakce na stres a odolnosti prostřednictvím do značné míry neznámého mechanismu ; gen podobný argonautu 4, primární protein podílející se na metylaci heterochromatinu a nedávno rozpoznaný jako kritický faktor pro systémovou signalizaci zprostředkovanou malými RNA, která je nezbytná pro reakce rostlin na (a)biotický stres a nedostatek živin ; předpokládaná argináza, která zdůrazňuje úlohu argininu jako prekurzoru pro biosyntézu polyaminů a oxidu dusnatého, které se používají jako poslové pro adaptaci rostlin na stres , a lektinový protein Hfr-2, který tvoří póry a je považován za důležitý faktor biotické odolnosti pšenice proti napadení mouchou Hessian a infekci houbami (Puccinia striiformis) a podílí se na změně vegetativní fáze u kukuřice , ale nemá žádnou známou funkci v regulaci abiotického stresu. V naší laboratoři nyní probíhá funkční charakterizace vybraného souboru genů A. hypochondriacus indukovaných více stresy, a to v arabidopsis, tabáku a/nebo amarantu zrnitém.

Transkripční profil ve stoncích

Porovnání knihovny cDNA získané ze stonků (S6) s knihovnami získanými z listů vystavených biotickému a abiotickému stresu (S2 až S5) umožnilo identifikovat malou skupinu transkriptů, jejichž exprese byla zjištěna výhradně ve stoncích. Pozoruhodné je, že akumulace několika dalších transkriptů byla vyšší ve stoncích než v listovém pletivu rostlin amarantu vystavených (a)biotickému stresu (viz doplňkový soubor 8). Pozorovaný profil transkriptů byl v souladu s dříve uvedenými údaji o transkriptomických analýzách stonků u Arabidopsis thaliana. Všechny anotované transkripty byly podobně jako ve výše uvedených studiích zařazeny do různých kategorií.

Biosyntéza ligninu a kutikulárního vosku byla zastoupena geny kódujícími proteiny pravděpodobně zapojené do biosyntézy monolignolu (např. cytochrom P450 reduktázy, potřebné pro aktivitu několika klíčových enzymů cytochromu P450 fenylpropanoidní dráhy ), transport monolignolu (např. ABC transportéry ) a export kutikulárních lipidů (např. rodina ABC transportérů bílo-hnědého komplexu ). Skromný počet zjištěných genů zvýšené biosyntézy ligninu pravděpodobně souvisí s tím, že k pokusům byly použity mladé rostliny amarantu, u nichž ještě neprobíhá aktivní lignifikace.

Vysoce zastoupena byla kategorie enzymů aktivních pro sacharidy. To nebylo překvapivé vzhledem k tomu, že tyto proteiny hrají zásadní roli v biosyntéze a modifikaci buněčné stěny, a proto jsou během vývoje stonku přísně regulovány. Zahrnovala řadu glykosyltransferáz a několik glykosylhydroláz (GH) reprezentujících rodiny s celulázou (GH9), β-1,3-glukanázou (GH3), xylanázu (GH10), xyloglukan endotransglukosylázu-hydrolázu (GH16), glukan endo-1,3-beta-D-glukosidázu (GH17), invertázu (GH31) a β-D-galaktosidázu (GH35). Tyto enzymy jsou různě potřebné pro rozvolňování a prodlužování buněčných stěn, tvorbu sekundárních buněčných stěn cévních tkání, hydrolýzu xylanové páteře, posttranslační modifikace (jako glykosylace) proteinů a mobilizaci energie ve formě sacharózy. Zjištěny byly také pektinové methylesterasy (PME), které se podílejí na modifikaci fyzikálních, chemických a biologických vlastností pektinů. Současná exprese inhibitoru PME pravděpodobně představovala potřebu regulovat PME v mladých stoncích amarantu, aby se zabránilo rigidizaci stěn spojené s aktivitou PME. Kromě toho byl zjištěn předpokládaný protein β-expansin; tyto proteiny modulují interakci mezi hemi-celulózami a celulózou pravděpodobně prostřednictvím narušení jejich společných vodíkových vazeb .

Ve skupině extracelulárních oxidoreduktáz byly nalezeny dvě peroxidázy, patřící do rodiny peroxidáz 25, resp. 64 . Bylo zjištěno, že peroxidázy jsou exprimovány ve středních až vysokých hladinách ve vyvíjejících se stoncích, kde se předpokládá, že snižují roztažnost buněčné stěny díky své úloze při tvorbě kovalentních vazeb mezi zbytky pektinu, proteiny bohatými na hydroxyprolin, jako jsou extensiny, a prekurzory ligninu. Byl identifikován jeden gen kódující multikoperoxidázu z rodiny SKS (SKS5). Funkce těchto proteinů ve vývoji stonku není dobře známa, ačkoli bylo nedávno zjištěno, že exprese SKS5 je zvýšená u ekotypů Thlaspi caerulescens s nadměrnou akumulací kovů. Další oxido-reduktázou identifikovanou ve stoncích amarantu byl 2-OG-Fe(II) oxygenázový protein neznámé funkce, o kterém bylo nedávno zjištěno, že je spojen s obrannými mechanismy proti houbovým infekcím u Arabidopsis .

Bylo identifikováno několik genů kódujících proteiny s předpokládanými interakčními doménami s polysacharidy a/nebo jinými proteiny. Mnohé z genů zařazených do této kategorie jsou kinázy, peptidové receptory a kinázy podobné receptorům, které regulují vývojové procesy v rostlinách, jako je CLAVATA1-like receptor , CLAVATA3/ESR-related receptor , Abnormal Leaf Shape 2 receptor-like kinase , leucine-rich repeat receptor-like kinase RLK7 a LRR XI-23 kinase . Ve stoncích byla rovněž vysoce exprimována řada proteinů bohatých na hydroxiprolin (glyko), které pravděpodobně představují arabinogalaktanové proteiny (AGP), strukturní proteiny (např. extenziny, proteiny bohaté na prolin, PRP) a příbuzná prolyl 4-hydroxyláza (katalytická podjednotka alfa-2) potřebná pro hydroxylaci prolinových zbytků. Byla navržena řada rolí AGP ve vývoji rostlin prostřednictvím jejich vlivu na určování buněčného osudu, somatickou embryogenezi a buněčnou proliferaci. Také se předpokládá, že AGP jsou signálními molekulami a spojují se s pektinovými polysacharidy, zatímco bylo prokázáno, že extensiny, PRP a další (např. proteiny bohaté na glycin) jsou exprimovány ve specifických typech buněk včetně xylému a floémových tkání .

Také byly přítomny geny kódující endopeptidázu podobnou Rhomboidu 2 a dva proteiny s inhibiční aktivitou: inhibitor lipidového transferového proteinu/trypsin-alfa amylázy a inhibitor cysteinové proteinázy. Kromě toho byly zjištěny také transkripty pro F-Box protein (SKIP2) a 26S proteasomovou ne-ATPázovou regulační podjednotku, o nichž je známo, že se podílejí na cílené degradaci proteinů spouštěné v reakci na různé podněty během růstu a/nebo různé stresové podmínky. Předpokládá se, že proteinázová aktivita a její modulace inhibitory proteináz je nezbytná pro zpracování a/nebo obrat proteinů buněčné stěny, generování peptidových signálů, programovanou buněčnou smrt a/nebo vyrovnávání míry expanze/proliferace buněk, které jsou společně nezbytné pro správný vývoj kmene .

V kategorii různých proteinů byly nalezeny geny kódující proteiny zapojené do metabolismu lipidů (GDSL-lipázy a předpokládaná glycerofosforyl diester fosfodiesteráza ), u nichž se předpokládá, že jsou důležité pro vývoj stonku, plantacyanin vázající měď (ARPN), u něhož se předpokládá, že reguluje oxido-redukční procesy v buněčných stěnách, několik proteinů, o nichž je známo, že jsou nezbytné pro udržení stonkových buněk v apikálním meristému výhonu (histon H2A; ; histokináza Aurora 2 ), tolerance vůči kovům (např.selenocystein metyltransferáza ) a složky cytoskeletu, které se pravděpodobně podílejí na dělení a prodlužování buněk . Nález transkriptu kódujícího katalytickou podjednotku LigB rodiny dioxygenáz otevírajících aromatické kruhy (tj. předpokládané dopa-dioxygenázy), významného enzymu v biosyntéze betacyaninu, a biosynteticky příbuzných glykosyltransferáz (GT) (např. GT z Phytolacca Americana a UDP-GT) byl v souladu s vysoce pigmentovaným fenotypem stonkové tkáně použité k vytvoření sekvenované knihovny cDNA. V naší laboratoři se nyní aktivně pracuje na určení struktury a regulace genů souvisejících s pigmentem, jejich expresních vzorců v závislosti na tkáni a stresu a jejich pravděpodobné úlohy v obraně proti herbivornímu hmyzu u amarantu obilného. Bylo také zjištěno několik TF. V souladu s předchozí zprávou byla většina TF, u nichž byla zjištěna vysoká exprese ve stonkovém pletivu amarantu, z rodin MYB, AP2-EREBP, GRAS, bHLH-domén a homeodomén (např. WOX4 ). TF ve stoncích jsou různě spojovány s regulací biogeneze a diferenciace cévních tkání, expresí fenylpropanoidních genů a vývojem vláken . Nakonec byla zjištěna vysoká úroveň exprese několika genů souvisejících s abiotickým stresem a obranou ve stoncích A. hypochondriacus. Přítomnost vysoce exprimovaných genů souvisejících s obranou byla v souladu s nedávnou zprávou, která ukázala, že geny zapojené do obranných a ochranných funkcí rostlin byly dominantní ve vyvíjejících se stoncích Populus trichocarpa. Současná přítomnost předpokládané jasmonát o-metyltransferázy a genu pro karboxylesterázu CXE kódujícího protein, který pravděpodobně dokáže identifikovat metyljasmonát (MeJA) jako svůj substrát (kromě metylsalicylátu a indol-3-acetátu) u Actinidia arguta, svědčí ve prospěch možné role MeJA v signalizaci, a to jak uvnitř amaranthu, tak mezi rostlinami, během biotického a/nebo abiotického stresu. Mezi další zajímavé geny identifikované ve stoncích amarantu, kterým byla nedávno přisouzena aktivní role v obraně proti patogenům, patří geny kódující epoxidhydrolázu 2 a VPE-1B , resp. Předpokládá se, že úloha epoxidhydrolázy v obraně souvisí s její účastí na detoxikaci, signalizaci a/nebo metabolismu antimikrobiálních sloučenin, zatímco význam VPE se odvozuje od její účasti na imunitě vyvolané elicitory, která je spojena s kombinovanou indukcí hypersenzitivní reakce (HR) a uzavřením stonků. Jak bylo uvedeno výše, exprese VPE je také spojena s reakcí na abiotický stres

.