Sanes a Lichtman použili k vložení těchto konstruktů Brainbow do myší pronukleární injekci. Když zobrazovali myší mozky, zjistili mnohem více než 3-4 barvy v důsledku tandemové integrace více kopií konstruktu (asi 8 u myší Brainbow-1.0.) Kombinatorický efekt více nezávislých rekombinačních událostí vede k duze barev. U tří kopií konstruktu by se dalo očekávat deset barev (viz tabulka vpravo); v různých zprávách Sanes a Lichtman pozorovali 90-160 různých barev v důsledku vyššího počtu kopií. Název Brainbow je pro tuto barevnou technologii skutečně výstižný.
Optimalizace systému: Brainbow-3
Přestože systém Brainbow poskytl neurovědcům širokou škálu barev potřebných k označení jednotlivých neuronů, trpěl také řadou omezení. Zaprvé, zobrazování myší tkáně Brainbow bylo náročné kvůli nízké intenzitě fluorescence, částečně způsobené fotoinstabilitou fluoroforů, a také kvůli tendenci fluoroforů shlukovat se v somatech neuronů. Za druhé, systém neumožňoval analýzu pomocí imunobarvení. Ačkoli jsou použité fluorofory fluorescenčně odlišné, jejich proteinové sekvence jsou vysoce homologické, což znemožňuje navrhnout protilátky specifické pro každý fluorofor. Za třetí, Brainbow-1 a Brainbow-2 obsahovaly každý „výchozí“ stav; například Brainbow-1.0 exprimuje RFP, když konstrukt neprošel rekombinací. Tento výchozí stav byl neúměrně exprimován většinou neuronů, což omezovalo počet odlišných barev, které bylo možné v dané oblasti pozorovat.
V roce 2013 Dawen Cai a spol. vydali zdokonalení technologie Brainbow, Brainbow-3.0, s cílem překonat výše uvedená omezení. Nejprve prověřili řadu fluorescenčních proteinů, aby našli ty s ideálními vlastnostmi (nízká agregace, vysoká fotostabilita a vysoká stabilita po fixaci.) Ze sedmi výsledných proteinů vybrali tři s nízkou úrovní fluorescence i sekvenčního překryvu (korálový mOrange2, medúzový EGFP a mořská sasanka mKate2.) Poté úspěšně vytvořili vlastní protilátky proti každému z těchto proteinů a potvrdili, že nedochází ke zkřížené reaktivitě, což otevřelo dveře pro imunobarevnou analýzu. Aby dosáhli rovnoměrného značení buněk, vytvořili farnesylované deriváty fluorescenčních proteinů, které se přímo dostávají do buněčných membrán. Membránová doprava farnesylovaných derivátů umožňuje značení jemných axonálních a dendritických procesů, které dříve nebyly viditelné pomocí Brainbow-1 a -2.
Obecná struktura Brainbow-1.0 je zachována v Brainbow-3.0, ale s mOrange2, EGFP a mKate2 jako fluorofory; mOrange2 je výchozí stav. Naproti tomu Brainbow-3.1 a -3.2 nevykazují výchozí fluorescenci v důsledku přidání STOP kazety blokující translaci hned za promotor. STOP kazeta obsahuje mutantní YFP, která nefluoreskuje, ale lze ji detekovat pomocí imunobarvení. Tato vlastnost usnadňuje screening Cre-negativních Brainbow myší za účelem určení počtu a typu buněk, ve kterých je konstrukt exprimován. Fotostabilita Brainbow-3.2 je lepší díky přidání posttranskripčního regulačního prvku viru hepatitidy svišťů (WPRE), který se běžně používá ke zvýšení hladiny transgenního proteinu.
Varianty systému Brainbow a aplikace mimo myší mozek
Kromě vylepšení systému Brainbow vyvinuli Sanes a Lichtman také doplňkový konstrukt Flpbow, který je funkčně podobný systému Brainbow založenému na Cre, ale je řízen rekombinázou FLP/FRT. Pokud jsou umístěny pod různými promotory, lze Brainbow a Flpbow použít ke značení odlišných buněčných populací.
Aby se snížila náročnost chovu zvířat nutná k produkci zvířat s transgeny Brainbow a Cre, Cai a spol. také vytvořili konstrukt Autobow obsahující Cre i XFP. Produkce Cre řídí rekombinaci a selekci XFP, po níž následuje samovýsek Cre. Tyto konstrukty jsou stabilně udržovány po dobu nejméně šesti generací.
Kromě neuronálních konstruktů pThy1-Brainbow má společnost Addgene k dispozici také dva adenoasociované virové vektory (AAV) Brainbow – AAV-EF1a-BbChT a AAV-EF1a-BbTagBY. Tyto konstrukty obsahují každý dvě XFP kvůli omezením velikosti spojeným s AAV; koinfekce s oběma konstrukty vytváří minimálně 8 barev. Použití AAV poskytuje prostorovou a časovou kontrolu bez nutnosti modifikace zárodečné linie a umožňuje použití Brainbow u různých druhů.
Další varianty byly vytvořeny jinými laboratořemi, včetně R26R-Confetti popsané v práci Hugo J. Snippert, et al. (2010) a strategie MAGIC Marker popsané v práci Karine Loulier, et al. (2014).
V současné době se techniky Brainbow používají také ke studiu modelových organismů, jako jsou drozofily a zebřičky. Brainbow u drozofil pomohl při mapování nervových obvodů, například spojení mezi motorickými neurony a nervosvalovým spojením. U zebřiček se metoda stala velmi užitečnou při sledování linií; „Zebrabow“ byl použit ke sledování vývoje rohovkového epitelu.
Pro vědce, kteří se zajímají o neurovědy a vývoj, je Brainbow díky široké škále a vysoké stabilitě barev cenným nástrojem pro značení a sledování jednotlivých buněk. Sanes a Lichtman odhadují, že barevné značení Brainbow zkrátilo dobu mapování daného úseku mozku nejméně o řád. Je zřejmé, že další zdokonalování techniky Brainbow přinese důležité poznatky o složité fyzikální organizaci mozku a dalších biologických systémů.
Zajímá vás použití Brainbow ve vašem výzkumu? Podívejte se na plazmidy Brainbow dostupné u společnosti Addgene!
Najděte plazmidy Brainbow @Addgene:
- Plazmidy Brainbow 1.0, 1.1, 2.1
- Plazmidy Brainbow 3.0, 3.1, 3.2
Transgenní strategie pro kombinatorickou expresi fluorescenčních proteinů v nervovém systému. Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Bennis RA, Sanes JR, Lichtman JW. Nature. 2007 Nov 1;450(7166):56-62. PubMed.
Technický přístup ke konektomu. Lichtman JW, Livet J, Sanes JR. Nature Reviews Neuroscience. 2008 Jun;9(6):417-22. doi: 10.1038/nrn2391. Epub 2008 Apr 30. PubMed.
Homeostáza střevní krypty je výsledkem neutrální konkurence mezi symetricky se dělícími kmenovými buňkami Lgr5. Snippert HJ, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, Barker N, Klein AM, van Rheenen J, Simons BD, Clevers H. Cell. 2010 Oct 1;143(1):134-44. PubMed.
Drosophila Brainbow: technika fluorescenčního značení založená na rekombináze k rozdělení vzorců nervové exprese. Hampel S, Chung P, McKellar CE, Hall D, Looger LL, Simpson JH. Přírodovědné metody. 2011 Mar;8(3):253-9. doi: 10.1038/nmeth.1566. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Flybow: genetické vícebarevné značení buněk pro analýzu nervových obvodů u Drosophila melanogaster. Hadjieconomou D, Rotkopf S, Alexandre C, Bell DM, Dickson BJ, Salecker I. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):260-6. doi: 10.1038/nmeth.1567. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Vylepšené nástroje pro Brainbow toolbox. Cai D, Cohen KB, Luo T, Lichtman JW, Sanes JR. Nature Methods. 2013 May 5:10(6):540-7. doi: 10.1038/nmeth.2450. Epub 2013 May 5. PubMed.
Zebrabow: multispektrální značení buněk pro sledování buněk a analýzu linií u zebřiček. Pan YA, Freundlich T, Weissman TA, Schoppik D, Wang XC, Zimmerman S, Ciruna B, Sanes JR, Luchtman JW, Schier AF. Development. 2013 Jul;140(13):2835-46. doi: 10.1242/dev.094631. PubMed.
Multiplexní sledování buněk a linií pomocí kombinatorických značek. Loulier K, Barry R, Mahou P, Le Franc Y, Supatto W, Matho KS, Ieng S, Fouquet S, Dupin E, Benosman R, Chédotal A, Beaurepaire E, Morin X, Livet J. Neuron. 2014 Feb 5;81(3):505-20. PubMed.
.