Variations in the Calvin-Benson cycle: selection pressures and optimization?

Calvin-Bensonův cyklus je základem fixace uhlíku u všech fotosyntetických organismů. O tom, do jaké míry se jeho fungování liší mezi jednotlivými druhy, je však známo poměrně málo. Pomocí metody profilování metabolitů byly objeveny rozdíly v hladinách klíčových meziproduktů Calvinova-Bensonova cyklu mezi druhy C3 a C4. Tyto rozdíly v zásobnících metabolitů byly pozorovány jak mezi C3 druhy, tak mezi C3 a C4 rostlinami. Tato práce vyvolává zajímavou možnost, že různé selekční tlaky na složky Calvinova-Bensonova cyklu vedly k jeho nezávislé optimalizaci mezi druhy.

V roce 1954 Melvin Calvin, Andrew Benson a James Bassham publikovali metabolickou dráhu používanou k fixaci atmosférického CO2 – Calvinův-Bensonův cyklus (Bassham et al., 1954). Jejich zásadní objevy byly založeny na krmení řasy Chlorella CO2 značeným 14C a sledování značení metabolitů v čase (Bassham et al., 1954; Sharkey 2018). Zjistili, že cyklus se skládá ze tří fází: nejprve enzym ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxyláza/oxygenáza (Rubisco) fixuje CO2 pomocí ribulosa-1,5-bisfosfátu (RuBP) jako akceptoru, přičemž vznikají dvě tříuhlíkaté molekuly, 3-fosfoglycerát (3-PGA). Za druhé, ATP a NADPH, které vznikají během fotosyntetického elektronového transportního řetězce (reakce fotosyntézy závislé na světle), se používají k fosforylaci a následné redukci 3-PGA na triosafosfát (triosa-P). Za třetí, akceptor CO2 RuBP je regenerován prostřednictvím řady reakcí (rámeček 1). Většina enzymů zapojených do tohoto cyklu byla objevena dříve nebo brzy poté (Horecker et al. 1951; Racker et al., 1953; Mayoudan et al., 1957). Od té doby se obecně předpokládá, že fungování Calvinova-Bensonova cyklu je u různých rostlinných druhů vysoce konzervované.

Rámeček 1.

Calvinův-Bensonův cyklus

Calvinův-Bensonův cyklus se skládá ze tří fází: (1) fixace uhlíku, (2) redukce a (3) regenerace akceptoru CO2.

Karboxylace probíhá prostřednictvím ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylázy/oxygenázy (Rubisco), která fixuje CO2 pomocí ribulosa-1,5-bisfosfátu (RuBP) jako akceptoru a přitom produkuje dvě tříuhlíkaté molekuly 3-fosfoglycerátu (3-PGA). 3-PGA je následně fosforylován fosfoglycerátkinázou (PGK) a v redukční fázi redukován glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázou (GAPDH) na triosefosfát (triose-P). Cyklus využívá 3 ATP a 2 NADPH na molekulu fixovaného CO2. Triosa-P může být transportována z chloroplastu k výrobě sacharosy v cytosolu. Fruktosa 1,6-bisfosfát aldolasa (FBP ald) může přeměnit triose-P na fruktosa-6-fosfát (F6P), meziprodukt používaný k výrobě škrobu. Triosa-P může být také přeměněna na RuBP v sérii regeneračních reakcí pro fixaci dalších molekul CO2.

Zkratky: Fruktóza-1,6-bisfosfát (FBP), fruktóza-1,6-bisfosfatáza (FBPáza), erytróza-4-fosfát (E4P), sedoheptulóza-1,7-bisfosfát aldoláza (SBP ald), sedoheptulóza-1,7-bisfosfát (SBP), sedoheptulóza-1,7-bisfosfatáza (SBPáza), sedoheptulosa-7-fosfát (S7P), transketoláza (TK), ribóza-5-fosfát (R5P), xylulóza-5-fosfát (Xu5P), ribóza-5-fosfát izomeráza (RPI), ribulóza-5-fosfát epimeráza (RPE), ribulóza-5-fosfát (Ru5P), fosforibulokináza (PRK). Enzymy, které katalyzují nevratné reakce, jsou zvýrazněny silnou tučnou šipkou (tj. Rubisco, FBPase, SBPase a PRK).

U naprosté většiny suchozemských rostlin probíhá Calvinův-Bensonův cyklus spolu s reakcemi fotosyntézy závislými na světle především v mezofylových buňkách listů. Rubisco však špatně rozlišuje mezi CO2 a O2 (Bowes et al., 1971) a fixace molekuly O2 místo CO2 vede k fotorespiraci – energeticky nákladné záchranné cestě k obnově RuBP. Po dramatickém poklesu koncentrace CO2 v atmosféře před 2,3 miliardami let (Bekker et al., 2004) se vyvinuly dva mechanismy koncentrace uhlíku, které omezily množství fotorespirace. Každá z těchto modifikací základního fotosyntetického procesu, fotosyntéza C4 a metabolismus křehkých kyselin (CAM), vznikla několikrát (Sage et al., 2011). Fotosyntéza C4 zahrnuje prostorové oddělení fotosyntézy tak, že složky reakcí závislých na světle i Calvin-Bensonova cyklu probíhají v buňkách mezofylu a svazkových pletiv (rámeček 2). Navzdory rozdílům v anatomickém umístění fixace uhlíku bylo dosud málo známo o tom, jak se může lišit fungování Calvinova-Bensonova cyklu u rostlin C4 oproti C3 a také mezi rostlinami C3.

Rámeček 2.

Management koncentrace uhlíku u rostlin C4

V roce 1966 Hal Hatch a Roger Slack objevili fotosyntézu C4 (Hatch a Slack, 1966), která zahrnuje mechanismus koncentrace uhlíku přidaný k běžné dráze fixace uhlíku C3. Pomocí značení 14C prokázali, že CO2 je v listech cukrové třtiny nejprve fixován na čtyřuhlíkatou kyselinu, nikoli na 3-fosfoglycerát (3-PGA) jako u C3 rostlin. Rostliny C4 používají fosfoenolpyruvátkarboxylázu (PEPC) jako počáteční enzym fixující uhlík v buňkách mezofylu. Čtyřuhlíková kyselina (malát nebo aspartát v závislosti na typu fotosyntézy C4) produkovaná v buňkách mezofylu pak vstupuje do buněk svazkových pochev, kde je dekarboxylována a uvolňuje se CO2. Tento mechanismus koncentrace uhlíku umožňuje, aby Rubisco během Calvinova-Bensonova cyklu v buňkách svazkových pochev působil téměř výhradně jako karboxyláza. Kromě rekonfigurace stávajících metabolických enzymů vyžaduje C4 dráha vývoj specializované anatomie listů (Kranzova anatomie), která zahrnuje zvětšení rozestupu žilek a velikosti buněk svazkových pochev. Klasicky byly rozpoznány tři různé typy C4 fotosyntézy, pojmenované podle primárního enzymu zodpovědného za dekarboxylační reakci v buňkách svazkových pochev: Typ NAD-ME, NADP-ME nebo PEPCK. Zkratky: karboanhydráza (CA), oxaloacetát (OA), NADP-dependentní malátdehydrogenáza (NADP-MDH), malát (M), NADP-dependentní enzym jablečný (NADP-ME), pyruvát (Pyr), pyruvát,ortofosfátdikináza (PPDK), fosfoenolpyruvát (PEP).

Různé metabolity Calvinova-Bensonova cyklu u různých druhů

Calvinův-Bensonův cyklus je bezpochyby jednou z nejkritičtějších biochemických drah na Zemi, neboť je cestou asimilace uhlíku u rostlin – srdcem fotosyntézy. Probíhá však tato dráha u všech rostlinných druhů stejně? Arrivault et al. (2019) profilovali množství metabolitů Calvin-Bensonova cyklu u pěti C3 rostlin (včetně Arabidopsis a několika důležitých plodin, jako je rýže, pšenice a maniok) a čtyř C4 rostlin (včetně kukuřice). Celkové metabolity byly extrahovány ze zralých listů a měřeny pomocí kapalinové chromatografie na reverzní fázi spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). Pro spolehlivou kvantifikaci byly vzorky obohaceny o vnitřní standardy metabolitů značených izotopy; 3-PGA byl kvantifikován enzymaticky. Metabolitové profily různých rostlinných druhů byly porovnány pomocí analýzy hlavních komponent.

Podstatné rozdíly v metabolitových profilech meziproduktů Calvin-Bensonova cyklu objevili Arrivault et al. (2019) u pěti studovaných druhů C3. Mezi meziprodukty, které se nejvíce lišily, patřily absolutní hladiny 3-PGA, triózy-P, ribulóza-5-fosfátu (Ru5P) a xylulóza-5-fosfátu (Xu5P). Relativní hladiny RuBP ve srovnání s hladinami meziproduktů, které se podílejí na regeneraci RuBP, se u jednotlivých druhů lišily. Kromě toho autoři prokázali variabilitu v relativních hladinách dvojic metabolitů, jako je fruktosa-1,6-bisfosfát (FBP) a fruktosa-6-fosfát (F6P), které jsou spojeny nevratnou reakcí FBPázy; a v dvojici metabolitů sedoheptulosa-1,7-bisfosfát (SBP) a sedoheptulosa-7-fosfát (S7P), které jsou nevratně interkonvertovány SBPázou. Ve většině případů se pět druhů C3 při analýze hlavních komponent od sebe jasně oddělilo. Míra jejich oddělení závisela na tom, zda byla data normalizována na čerstvou hmotnost, obsah chlorofylu nebo obsah bílkovin. Rozdíly v těchto meziproduktech v rámci pěti druhů C3 ukazují na rozdíly v tom, jak rostliny provozují stejnou dráhu fixace uhlíku. Tyto informace mají důsledky pro strategie zaměřené na zlepšení fotosyntézy. Například SBPáza může omezit rychlost fotosyntézy (Zhu et al., 2007) a její nadměrná exprese může zvýšit účinnost fotosyntézy (Lefebvre et al., 2005; Feng et al. 2007; Ding et al., 2016; Driever et al., 2017). Změna aktivity jediného enzymu v Calvinově-Bensonově cyklu tak může ovlivnit rychlost fotosyntézy a následně biomasu a výnos. Je však známo, že účinnost tohoto přístupu se u jednotlivých druhů liší. Již existující rozdíly v hladinách metabolitů SBP a S7P mezi druhy C3, které uvádí Arrivault et al. (2019), jsou proto důležité a mohou poskytnout vhled do proměnlivé reakce fotosyntézy na zvýšení množství SBPázy.

Jelikož mechanismus koncentrace uhlíku u rostlin C4 omezuje fotorespiraci, bylo možná méně překvapivé, že první produkt fotorespirace, 2-fosfoglykolát (2-PG), byl u druhů C4 méně hojný než u druhů C3. Kromě toho měly rostliny C4 nižší hladiny RuBP než rostliny C3, což odpovídá jejich nižším investicím do Rubisco. Nicméně i když byly hladiny 2-PG a RuBP ze souboru dat vynechány, hladiny metabolitů C3 a C4 se v analýze hlavních komponent téměř vždy oddělily. Tyto rozdíly byly konzistentní bez ohledu na to, zda byla data normalizována na čerstvou hmotnost, obsah chlorofylu nebo obsah bílkovin, a změny tak naznačují, že enzymy odpovědné za tvorbu metabolitů provádějí katalýzu u různých druhů různou rychlostí. Autoři pro popis těchto rozdílů používají termín „provozní režim“ Calvinova-Bensonova cyklu – cyklus funguje u různých druhů odlišně, přestože se na něm podílejí stejné enzymy, což vede k pozorovaným změnám v relativních hladinách meziproduktů. Navrhují proto, že rozdíly v Calvinově-Bensonově cyklu mezi rostlinami C3 a C4 jsou širší než pouhé prostorové přemístění do buněk svazkových pochev u těchto rostlin a zahrnují adaptaci v režimu fungování cyklu.

Budoucí perspektivy

Zjištění, že režim fungování Calvinova-Bensonova cyklu se může lišit, je zajímavé, zejména s ohledem na to, že struktura dráhy (z hlediska zapojených enzymů a jejich reakční sekvence v rámci cyklu) je vysoce konzervovaná. V průběhu milionů let od prvního výskytu cyklu se však poměr O2 a CO2 v atmosféře dramaticky změnil. Předpokládá se, že tyto změny přispěly k tomu, že se u některých rostlinných druhů vyvinuly mechanismy koncentrace uhlíku. Autoři nyní navrhují, že nízké hladiny CO2 v kombinaci se specifickými podmínkami prostředí mohly vést k rozvoji různých způsobů fungování Calvinova-Bensonova cyklu. Pozorované rozdíly v profilech metabolitů tak mohou odrážet odlišné selekční tlaky na způsob regulace Calvin-Bensonova cyklu u různých linií rostlin. Přístup, který autoři použili k analýze meziproduktů Calvinova-Bensonova cyklu, by nyní mohl být aplikován na více druhů, což by bylo obzvláště zajímavé, pokud by zahrnovaly širší škálu rostlinných čeledí v různých prostředích. To by mohlo odhalit, zda variabilita striktně sleduje fylogenetické taxony nebo specifická prostředí, kterým se rostliny přizpůsobily.

Všechny rostliny C4 analyzované v práci Arrivaulta a kol. také provádějí NADP-ME typ fotosyntézy C4. Slibným směrem dalšího studia by tedy bylo prozkoumat, zda jsou podobné změny v meziproduktech Calvin-Bensonova cyklu pozorovány u všech tří typů metabolismu C4, nebo zda jsou specifické pro typ NADP-ME.

Tato práce je vynikajícím východiskem pro zjištění, jak jsou tyto různé způsoby Calvin-Bensonova cyklu řízeny na molekulární úrovni. Profilování metabolitů sice umožňuje nezaujatý přístup k posouzení rozdílů v hladinách meziproduktů mezi různými druhy, ale základní příčiny těchto rozdílů je třeba ještě určit. Rozdíly mezi druhy mohou být důsledkem rozdílů v genové expresi a následné aktivitě proteinů, rozdílů v sekvenci aminokyselin ovlivňujících kinetiku nebo posttranslační regulace enzymů. Pozoruhodné je, že téměř všechny enzymy Calvinova-Bensonova cyklu podléhají alespoň nějaké formě redoxní regulace, většinou prostřednictvím systému thioredoxin (TRX)/ferredoxin (Fd) (Buchanan a Palmer, 2005; Michelet et al. 2013). Integrace těchto údajů o množství transkriptů, proteinů a aktivitě enzymů s hladinami metabolitů může odhalit molekulární podstatu variability. Kromě toho mohou pozorované rozdíly v poolech metabolitů souviset také s nároky na určité meziprodukty, zejména ty, které jsou odebírány z Calvin-Bensonova cyklu. Například tok cyklem mohou ovlivňovat výstupní cesty umožňující syntézu škrobu (prostřednictvím F6P), sacharózy a isoprenoidů (prostřednictvím triózy-P), aminokyselin prostřednictvím šikimátové cesty (prostřednictvím E4P) a také thiaminu a nukleotidů (prostřednictvím R5P) (Raines, 2011).

Arrivault et al. (2019) uvádějí zajímavé rozdíly v tom, jak komponenty Calvin-Bensonova cyklu fungují u různých druhů rostlin. To bude jistě katalyzátorem dalších studií o tom, jak rostliny přizpůsobily tuto základní a starobylou cestu fixace uhlíku různým prostředím.

.