Vysoce polymorfní inzerce v genu pro amelogenin v chromozomu Y může být využita pro evoluční biologii, populační genetiku a určování pohlaví u Cetacea a Artiodactyla

Amelogenin lze využít pro molekulární určování pohlaví a evoluční genetiku u Cetartiodactyla

Amplifikace studovaného úseku amelogeninového lokusu pomocí druhově specifických primerů SC1-SC2 vedla ke zjevnému polymorfismu velikosti v závislosti na pohlaví u všech kytovců (obr. 1). 1) s unikátním pásem 521 bp u samic (dvě kopie Amel-X) a dalším pásem 980 bp pro Amel-Y u samců. Tento vzorec byl zřejmý u samců velryb rodu Baleen (Mysticetes), ale u samců delfínů nebyla zjištěna odpovídající amplifikace Amel-X, ledaže by byly použity primery X5-X6 odvozené ze sekvence lidského amelogeninu. Předchozí studie ukázaly, že amplifikace amelogeninu je náchylná k alelickému vypadávání nebo přinejmenším k přednostní amplifikaci . Tyto jevy lze vysvětlit několika faktory. Obvykle se upřednostňuje amplifikace alely s menší velikostí, pokud je limitujícím faktorem množství polymerázy nebo v případě degradace templátové DNA . Malé množství o DNA může také zvýšit stochasticitu žíhání . Naše výsledky však těmto situacím neodpovídají, neboť upřednostňovaná alela (Amel-Y) je vždy největší. Na druhé straně rozdíly v obsahu GC a neshody v sekvencích žíhání mohou být příčinou rozdílné amplifikace. Námi studované amelogeninové fragmenty se vyznačují vyšším obsahem GC při amplifikaci z chromozomu X (56 %) než z chromozomu Y (47 %). Tento rozdíl může být důsledkem nevložení fragmentu Amel-X. Tato vlastnost, stejně jako 2 bp dlouhá neshoda mezi Amel-X delfína a 5′ koncem reverzního primeru SC2 (obr. 2), může upřednostňovat amplifikaci kopie Y u delfínů (obr. 1b). Amplifikace samčích vzorků delfínů SC3 (primer bez neshody, viz obr. 2) namísto SC2 totiž obnoví dva pásy, které byly pozorovány u velryb. Přítomnost této velké inzerce v kopii Amel-Y lze využít k určení pohlaví pravděpodobně u všech druhů kytovců.

Abychom definovali zlomové body místa inzerce Y a prozkoumali jeho evoluční historii, sekvenovali jsme různé kytovce (uvedené v Metodách; sekvence jsou uloženy pod následujícími přístupy: EMBL:AM744958 až AM744971). Po zarovnání s dostupnými sekvencemi z Artiodactyla (viz seznam v Metodách) jsme u všech ostatních Cetartiodactyla kromě prasete zjistili stejný polymorfismus (obr. 3): 460-465 bp inserce (velikost je funkcí indelů v rámci různých jedinců nebo druhů) umístěná mezi 4. a 5. exonem (188. až 651. pozice sekvencí Y, např. EMBL:AM744958). Názvy haplotypů a jim odpovídající přístupy jsou uvedeny v tabulce 1. Podobnost sekvencí byla ověřena spuštěním nástroje BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) nad sekvencemi z kolekce nukleotidů GenBank nr/nt s algoritmem megablast (určeným pro sekvence s vysokou podobností). Kromě hovězího a ovčího Amel-Y se jediné dva relevantní (78 a 83% homologie, E-hodnoty 4,10-68 a 3,10-53) shody shodovaly s fragmentem na sedmém chromozomu u prasat (cca 250 bp), což naznačuje, že by se mohlo jednat o transpoziční element.

Přítomnost této inzerce interpretujeme jako synapomorfii (sdílený znak) Cetartiodactyla s výjimkou prasat a pravděpodobně dalších časných odvozených skupin (velbloudi, hroši; , viz obr. 3). Kromě této dlouhé inserce bylo zarovnáním sekvencí zjištěno 46 dalších indelů (pozice a velikosti jsou podrobně uvedeny na obr. 5). Indele jsou zvláště užitečné pro testování fylogenetických hypotéz, protože mohou poskytnout spíše informace o dávných divergencích než informace o populaci. Hodnotili jsme proto, zda se fylogenetické topologie liší, pokud zohledníme či nezohledníme informace obsažené v těchto indelech. Sekvence kytovců shrnuté v tabulce 1 i sekvence Artiodactyla byly tedy analyzovány jednak klasicky, s mezerami kódovanými jako chybějící znaky, a jednak s mezerami kódovanými jako doplňkové binární znaky (viz obr. 5). Pro každou analýzu byla provedena dvě nezávislá bayesovská vyhledávání. Fylogenetické stromy uvedené na obr. 4 jsou výsledkem konsenzu 20 000 stromů vybraných poté, co směrodatná odchylka mezi oběma běhy klesla pod 0,01. Zobrazují vysoce podporované uzly. Fylogenetická analýza provedená na kompletním segmentu (obr. 4a) potvrdila shlukování podle kopie pohlavního chromozomu u Cetartiodactyla (Stenella cœruleoalba, Balænoptera physalus, Grampus griseus, Tursiops truncatus, Bos taurus a Ovis aries), zatímco Amel-X a Amel-Y se shlukovaly u ostatních savců (Homo sapiens, Sus scrofa) společně s Amel-X z Cetartiodactyla. Na druhou stranu fylogeneze odvozená bez zohlednění inzerce poskytla odlišný výsledek (obr. 4b): zatímco u kytovců se haplotypy shlukovaly také podle chromozomů, u ostatních Cetartiodactyla nebyl patrný žádný signál související ani s druhovou historií, ani s nosností chromozomů. Zdá se tedy, že fylogenetický signál související s druhovou historií sílí, když sledujeme strom od Cetartiodactyla směrem k primátům. Toto částečné, homoplazmatické, přetrvávání fylogenetického signálu lze vysvětlit vlivem oblasti obklopující inzert. Mohlo by to být důsledkem stáří inzerce (74-87 mil. let ). Následná ztráta homologie mohla být příčinou divergentnější evoluce mezi chromozomy u některých taxonů (Cetacea) než u jiných (Artiodactyla).

Bylo by zajímavé studovat tuto oblast na úrovni celého kladu kombinací sekvenčních a indelových znaků ve stejné analýze. To by mohlo poskytnout vodítka k ověření mnoha hypotéz o bazální radiaci Cetartiodactyla (např. ). Vzhledem k pravděpodobně bazálnímu postavení Suioidea a Tylopoda ve fylogenezi Cetartiodactyla ( a obr. 3) předpokládáme, že k hlavní evoluční události reprezentované inzertem (znázorněným šipkou na obr. 4a) došlo jednou v kladu Cetacea-Ruminantia a nikoli ve zbývajících Cetartiodactyla.

Přítomnost této velké inzerce v kopii Amel-Y může být užitečná pro určení pohlaví.

Evoluční historie také naznačuje, že naše technika určování pohlaví je kromě kytovců použitelná pro celou řadu druhů Cetartiodactyla, včetně domácích a volně žijících druhů, zejména pro široce rozšířené Ruminantia (Bovidae, Capridae a pravděpodobně Cervidae). Není však vhodná pro Suiformes a jsou nutné další studie, které potvrdí, že tato technika není použitelná ani pro Camelidae, vzhledem k jejich ještě bazálnějšímu postavení ve fylogenezi Cetartiodactyla.

Využití při hodnocení rodokmenu a populační genetice

U delfínů byly fragmenty Amel-Y amplifikované pomocí dvojice primerů SC1-SC2 snadno sekvenovány bez nutnosti klonování, protože amplifikace byla specifická pro Y chromozom. Z deseti sekvenovaných vzorků delfína pruhovaného bylo devět samců a mohli jsme odvodit sedm různých Y-haplotypů (jeden haplotyp reprezentovaný třemi jedinci a čtyři individuální haplotypy) nesoucích 64 polymorfních míst (nukleotidová diverzita π = 0,004 ± 0,0007). Polovina z nich se nacházela v insertu ~460 bp. Zarovnání polymorfních míst je uvedeno na obrázku 5 (a). Je nápadné, že tyto sekvence vykazovaly dvě vysoce divergentní haploskupiny, které se lišily v průměru o 49 substitucí. To se shoduje s našimi výsledky, které podporují pravděpodobnou existenci dvou poddruhů v rámci Středozemního moře (nepublikované údaje). Jedna z těchto haploskupin navíc vykazovala vysoký stupeň polymorfismu s 24 informativními místy, zatímco ostatní pouze osm. Tyto hodnoty jsou dostatečné pro použití v rodokmenové analýze a populační genetice, protože Y chromozom je u tohoto druhu obdobou mitochondriální d-smyčky. U delfína pruhovaného je totiž vnitrodruhová (meziskupinová) divergence větší než mezidruhová s průměrnou hodnotou 45 nukleotidových substitucí mezi sekvencemi delfína pruhovaného a plejtváka obrovského. Při porovnání obou populací delfína pruhovaného je průměr 0,048 ± 0,01 substituce na jedno místo. To je srovnatelné s divergencí pozorovanou mezi každou populací a delfínem obecným (0,058 ± 0,03) a potvrzuje, že nukleotidová diverzita je o jeden řád vyšší než rozsah pozorovaný (10-4) u markerů chromozomu Y u savců . Stejně jako u mitochondriální d-smyčky velikost amplifikovaného fragmentu mírně omezuje použití této techniky. Některé znehodnocené vzorky se neamplifikují; přesto byl zvláště znehodnocený vzorek vorvaně stále amplifikovatelný (údaje nejsou uvedeny).

Protože se očekává, že populace chromozomu Y má malou efektivní velikost, je pravděpodobnější, že bude ovlivněna genetickým driftem. Odráží tedy nedávné demografické události, jako jsou úzká hrdla, expanze nebo efekty zakladatelů . Ke studiu tohoto druhu událostí je zapotřebí marker, jehož diverzita je dostatečně vysoká, aby umožnila rekonstrukci genealogií s co nejmenšími nejasnostmi a v oblastech, kde rekombinace nenarušuje jedinečnost stromů. Pro tento účel představují cenné markery vysoce variabilní mikrosatelity, které však vyžadují intenzivní výpočetní metody, aby bylo možné zohlednit nejistoty ve stromech vyplývající z alel, které jsou shodné podle stavu a nikoli podle původu (homoplazie) . Přidání nového sekvenčního markeru je proto zajímavé pro populační genetiku chromozomu Y u Cetartiodactyla. Bayesovský odhad mutační rychlosti na každém okraji obou stromů na obr. 4, vypočtený společně s fylogenetickou inferencí, navíc ukazuje vysoké hodnoty pro marker jaderné DNA: mezi 10-8 a 10-10 substitucí na místo a rok ve všech větvích Cetartiodactyla. Tato hodnota je prostřední mezi hodnotami mitochondriální d-smyčky a jaderné DNA u savců .

Funkční perspektivy v evoluci amelogeninu

Našli jsme dva stop kodony na aminokyselinových pozicích 98 a 99 exonu 5 ve všech kopiích amelogeninu na chromozomu Y u čtyř studovaných druhů kytovců (pozice 988-993 sekvence EMBL:AM744959). Produkt genu Amel-Y tedy může být u těchto druhů zkrácený nebo může představovat pseudogen, jak již bylo pozorováno u druhů z většiny ostatních eutheriánských kladů

.