Konvekse Arrhenius-plots og deres fortolkning

I de seneste år har et stigende antal undersøgelser målt temperaturafhængigheden af enzymeresaktioner for både termostabile og mesostable enzymer (enzymer fra organismer, der vokser optimalt ved henholdsvis høj temperatur og ved normal kropstemperatur). Temperaturafhængigheden vises normalt i et Arrhenius-plot, som er den naturlige logaritme af hastighedskoefficienten i forhold til reciprokken af den absolutte temperatur (fig. 1). Nogle af metoderne til måling af temperaturafhængigheden af reaktionshastigheder er også blevet anvendt til måling af temperaturafhængigheden af de kinetiske isotopvirkninger (KIE’er) af de katalyserede reaktioner, og sådanne eksperimenter giver eksperimentelle data, der er meget relevante for karakteriseringen af reaktionernes dynamiske flaskehalse (1-6). Der er blevet fremlagt en lang række teoretiske modeller til fortolkning af denne type data (7-19).

Eksperimenter på reaktioner katalyseret af en række termostabile og mesostabile dehydrogenase- og oxidaseenzymer har vist, at Arrhenius-plottet for det kemiske trin i nogle tilfælde er konvekst (20-23). I nærværende artikel kommenterer vi betydningen af denne observation, og vi giver en fortolkning af dette fund, der placerer det i det bredere perspektiv af ikke-biologisk kemisk såvel som biokemisk kinetik. I denne artikel påpeges det, at den konvekse Arrhenius-adfærd lægger en alvorlig begrænsning på den mikrokanoniske unimolekylære hastighedskoefficient for det kemiske trin. Især kan vi gå ud over den indlysende fortolkning, at et konvekst Arrhenius-plot kan fortolkes som en lavere hastighed end forventet ved høje temperaturer, og vi kan under visse betingelser sige, at den mikrokanoniske unimolekylære hastighedskoefficient for det kemiske trin faktisk må falde med stigende energi.

Det er generelt ønskeligt at adskille fortolkningen af eksperimentelle data i to trin. Først udleder vi generelle konsekvenser, der hviler på et solidt fundament som termodynamik og generelle principper for statistisk mekanik. For det andet går vi videre til mere mikroskopisk detaljerede modeller, der hviler på et mindre sikkert grundlag. Det nye aspekt af den foreliggende analyse vedrører udelukkende det første trin.

Det slående træk ved reaktionerne i refs. 20-23, som vi diskuterer her, er den positive konveksitet C i deres Arrhenius-plots, hvor 1 k(T) er den katalytiske hastighedskoefficient, og T er temperaturen. Vi skriver 2 hvor 3 Ea er den temperaturafhængige fænomenologiske aktiveringsenergi, og R er gaskonstanten. En positiv konveksitet betyder således, at Ea falder med stigende temperatur. Inden for det brede kinetikområde, uden at begrænse sig til enzymkinetik, er ikke-lineære Arrhenius-plots, når de kan observeres, næsten altid konkave, dvs. at C er negativ. Dette generelle resultat forklares ved Tolmans fortolkning af aktiveringsenergien, som kan skrives som (25-27) 4, hvor en dobbelt overstregning angiver et gennemsnit over alle reagerende systemer, og en enkelt overstregning angiver et gennemsnit over alle systemer, uanset om de reagerer eller ej. Tolmans ligning 4 siger med andre ord, at det negative af den lokale hældning i et Arrhenius-plot kan fortolkes som lig med den gennemsnitlige energi af de molekyler, der reagerer, minus den gennemsnitlige energi af alle mulige reaktanter. For unimolekylære reaktioner af en termisk afbalanceret art: 5 og 6 , hvor E er den samlede energi, dP/dE er den normaliserede sandsynlighedstæthed for, at et system har energi E i et kanonisk ensemble ved temperatur T, og k(E) er den unimolekylære hastighedskoefficient for et mikrokanonisk ensemble ved energi E.§ Normalt stiger E̿ hurtigere end Ē med stigende T, fordi k(E) normalt er en stigende funktion af energien.¶ Dette forklarer, hvorfor Ea normalt stiger med T, og dermed hvorfor C er negativ. Et konvekst Arrhenius-plot betyder, at E̿ falder eller stiger mindre hurtigt end Ē, når temperaturen stiger, og i næste afsnit argumenterer vi for, at dette normalt indebærer, at k(E) falder med stigende energi over det område af energi, der dominerer integralerne i Eq. 6.

Man kan lave et mere præcist udsagn om konsekvensen af, at E̿ falder eller stiger mindre hurtigt end Ē, når temperaturen stiger. Ved at bemærke, at 7 hvor β er 1/RT, og ρ(E) er tilstandstætheden, og ved at bruge Eks. 4-6 kan man let vise, at 8 Således er udsagnet om, at dEa/dT er negativ, det samme som udsagnet om, at fordelingen af reaktionsenergier er smallere end fordelingen af reaktantenergier. Hvis dP/dE var symmetrisk omkring Ē, ville fortegnet på dEa/dT afhænge af formen af funktionen k(E) og ikke kun af dens fortegn. Men dP/dE er faktisk en meget skæv funktion. For typiske molekyler kan dens form tilnærmes godt ved at sætte ρ(E) i Eq. 7 lig med En-1, hvor n er omtrent lig med antallet af frihedsgrader (31). Hvis man antager denne form og også antager, at k(E) varierer langsomt og lineært over det vigtige område af integralerne i Eq. 6, kan man vise, at højre side i Eq. 8 er proportional med dk/dE med en positiv proportionalitetskonstant. For mere komplicerede k(E)-funktioner har man ikke længere nøjagtig proportionalitet, men retningen af virkningen er fastlagt af den positive skævhed i dP/dE. Selv om identiteten af tegnene på dEa/dT og dk/dE ikke er en matematisk sætning, forventes den at gælde for normale tætheder af tilstande og glatte k(E)-funktioner.

Dette resultat udgør en begrænsning for enhver mikroskopisk fortolkning, og – hvilket er lige så vigtigt – det foreslår nye mikroskopiske fortolkninger. Lad os f.eks. antage, at reaktantkonfigurationsrummet kan opdeles i to typer konformationer, hvoraf den ene (kaldet type R) er reaktiv med hastighedskoefficienten kR(E), og den anden (kaldet type N) er ikke-reaktiv med en hastighedskoefficient på nul. Så 9 hvor PR(E) er den betingede sandsynlighed for, at et system med energi E befinder sig i en konformation af type R. Dette giver en mekanisme for, at k(E) falder med E, dvs. at PR(E) falder hurtigere med E, end kR(E) stiger. Dette kan ske, fordi systemer med højere energi besøger et bredere område af faseloftet og dermed tilbringer en mindre del af deres tid i et enkelt begrænset område. Denne fortolkning kan være af særlig betydning for enzymologi. I de seneste år har adskillige undersøgelser været beskæftiget med at forstå konformationssamlingens rolle i enzymkatalysen (17, 18, 22, 32-37). I en nyere gennemgang argumenterede Bruice og Benkovic (17) for, at de aktive konfigurationer, som det enzymatiske kompleks udtager prøver af, ikke har højere energi end den generelle population af konformer, og at det kan være bestemmende for reaktionshastigheden, at disse konformationer er udfyldt. I modsætning til de undertiden detaljerede modeller i de citerede artikler er den nuværende fortolkning meget generel uden at påberåbe sig nogen særlig mikroskopisk molekylær mekanisme eller model, f.eks. tunnelføring, der fremmes af termisk exciterede enzymfluktuationer (11, 13, 38, 39), beregninger af den frie aktiveringsenergi, der omfatter en passende prøve over konformationer (40), eller specifikke mekanismer for overgange mellem mikrotilstande med varierende konformationel fleksibilitet (41-44). Ikke desto mindre kan den klart rumme mere specifikke fortolkninger som f.eks. et protein, der er stift ved lav T, eller en dynamisk bevægelse, der kræver population af specifikke lav-energi vibrationstilstande. Intet af det, vi har sagt her, giver imidlertid specifik støtte til sådanne modeller, hvis gyldighed bør undersøges ved hjælp af yderligere eksperimenter og detaljerede simuleringer. I denne diskussion er der ikke specifikt henvist til effekter, der er forbundet med sammenbruddet af overgangstilstandsteorien. Kvanteeffekter som tunneling kan rummes ved simpelthen at inkludere dem i k(E) eller kR(E).

I forbindelse med vores analyse kan de ovenfor nævnte resultater for termofil alkoholdehydrogenase ADH-hT (22, 32) fortolkes i form af de relative tendenser i E̿ og Ē, når temperaturen ændres. En udbredt hypotese er, at termofile enzymer har udviklet sig til at fungere i deres fysiologiske niche, dvs. ved forhøjet temperatur, og at de er mindre aktive ved stuetemperatur (i nogle tilfælde endda mindre aktive end forventet ud fra deres aktiveringsenthalpi ved fysiologisk temperatur). Vores analyse kan give en forbindelse mellem dette begreb og beregninger, der vedrører identifikation af aktive og ikke-aktive konformationer (16, 17). Wrba et al. (21) rapporterede f.eks. en empirisk observation om, at for enzymer med forskellige smeltetemperaturer er forskellen i temperaturerne for maksimal krumning i Arrhenius-plots lig med forskellen i smeltetemperaturen. Dette kan være relateret til forskydninger i PR(E)- og kR(E)-afhængigheden af E i de områder, der er vigtige ved overgangstemperaturerne for denaturering og aktivitet. Som et yderligere eksempel bemærker vi, at det for nylig blev foreslået, at det “måske ikke er overraskende, at for C-H-bindingsspaltningsreaktioner er en fordeling af termisk energi i lavfrekvente proteinmodes en vigtig faktor”. Disse modes kan blive betydeligt exciteret ved omgivelsestemperatur, i modsætning til C-H-strækningsmoden, som forventes at være stort set begrænset til sit nulpunktsenerginiveau” (22). Denne type overvejelser kan relateres til temperaturafhængigheden af E̿ og Ē og dermed til konkavitet eller konveksitet af Arrhenius-plots.

Den generelle konklusion om energiafhængigheden af den mikrokanoniske hastighedskoefficient gælder også for konvekse Arrhenius-plots, som lejlighedsvis observeres i andre undersøgelser. Hvis man skal anvende disse argumenter, skal man være omhyggelig med at sikre, at det konvekse Arrhenius-plot repræsenterer en ægte elementær reaktion med internt ligevægtige reaktanter. For eksempel kan det i prototypen af steady-state-problemet 10 hvor 11 med 12 anvendes på k1, k-1 eller k2, men ikke generelt på k. Men hvis k-1 og k1 er meget større end k2, så bliver k en elementær hastighedskoefficient for A → C, og ingen konklusioner ændres af præ-ligevægten før det hastighedsbestemmende trin. Dette gælder endvidere for det tilfælde, hvor k2 er meget større end k1 og k-1, hvor k bliver til k1. Et særligt tilfælde, hvor den stationære tilgang kan anvendes, er det tilfælde, hvor A svarer til den ubundne reaktant og enzymet, tilstand B er Michaelis-komplekset, og tilstand C er produktet (45). Bemærk, at i dette tilfælde bør k1 (i ligning 12) være en anden ordens hastighedskonstant, hvilket fører til Michaelis-ligningen: 13 hvor er reaktantkoncentrationen (substrat), Vmax er reaktionshastigheden ved meget højere end KM, som er Michaelis-konstanten, (k2 + k-1)/k1, for Eq. 10. Diskussionen gælder ikke for effektive hastighedskoefficienter, der skyldes en ændring i det hastighedsbestemmende trin eller ændringer i den effektive enzymkoncentration , og heller ikke for hastighedskoefficienter med hysterese, der kan tilskrives glasdannelse. Dette punkt bør understreges for enzymatiske reaktioner: repræsenterer de målte hastigheder rent faktisk en meningsfuld konsistent hastighedskonstant over hele temperaturområdet? I en tidlig rapport om konvekse Arrhenius-plot for den termofile alkoholdehydrogenase fra Bacillus stearothermophilus (ADH-hT) blev alle målinger f.eks. udført med den samme substratkoncentration (som mættede enzymet ved stuetemperatur), og Vmax blev præsenteret (47). I en senere rapport (22) blev det konstateret, at KM stiger med temperaturen, så ved høj temperatur var KM ikke tilstrækkelig stor, og den målte hastighed viste sig at være langsommere end Vmax, hvilket gav et tilsyneladende konvekst Arrhenius-plot. Selv for den enkleste realistiske enzymkinetik bør mekanisme 10 suppleres med et produktfrigivelsestrin, og dataene bør analyseres under behørig hensyntagen til forpligtelsen til katalyse og katalyseforholdet (48, 49); ellers kan den målte kcat vise en anden temperaturafhængighed end den intrinsiske k2. Refs. 20-24 er udvalgt som eksempler, hvor man har været særlig omhyggelig med at sikre og påvise, at Arrhenius-plottet svarer til et enkelt hastighedsbegrænsende elementært kemisk reaktionstrin som funktion af temperaturen. Rubach og Plapp (personlig kommunikation af upublicerede resultater) anvendte f.eks. stop-flow pre-steady state-teknikker til at måle KIE’er på mikroskopiske hastighedskonstanter for at studere den reaktion, der katalyseres af hestelever alkoholdehydrogenase. De fandt konvekse Arrhenius-plots for både hydrid- og deuteridoverførsel, men ingen temperaturafhængighed af KIE’erne, og de påviste, at ingen ændring i det hastighedsbestemmende trin sandsynligvis ville påvirke deres resultater. Vi udelukkede desuden de tilfælde, hvor temperaturområdet tillader irreversibelt smeltet eller delvist smeltet protein. I modsætning til de enzymatiske eksempler, der viser konveks Arrhenius-adfærd med et enkelt elementært trin, nævner vi tilfældet med hudpermeation af lægemidler, hvor der er observeret konveks Arrhenius-adfærd, men hvor de elementære trin ikke er blevet eller ikke kan sorteres fra (50, 51). Til sammenligning med permeation gennem huden nævner vi også, at det noget bedre definerede tilfælde af ikke-Arrhenius-temperaturafhængighed af diffusion i amorfe faste stoffer er blevet modelleret ved hjælp af en multistep site-hopping-model (52, 53).

Et eksempel fra organisk kemi giver en nyttig illustration af disse begreber i forbindelse med en temperaturafhængig strukturel reorganisering. Limbach har observeret konvekse Arrhenius-plots (personlig kommunikation af upublicerede resultater) for den base-katalyserede intramolekylære protonoverførsel i 1,3-bis-(4-fluorphenyl)-triazol opløst i ethylmethylether . Hastighedskoefficienten repræsenterer et gennemsnit over forskellige hydrogenbundne former af reaktanten, især det frie molekyle og komplekset med base. Protonoverførslen finder sted i komplekset. Den konvekse Arrhenius-krumning skyldes, at molekylet ved høj temperatur overgår til den ikke-komplekse form, hvor barrieren for protonoverførsel er større (ref. 55 og H. H. Limbach, personlig kommunikation). Tolman-tolkningen er således ikke strengt anvendelig, fordi hastighedskoefficienten ikke repræsenterer et enkelt elementært trin. Arrhenius-plottet for reaktionen fra begge former hver for sig ville formentlig være quasilineær eller konkav. Hvis de forskellige hydrogenbundne former imidlertid betragtes som konformer af en enkelt reaktant, kan Tolman-tolkningen anvendes, og den illustrerer et molekyle, der reagerer langsommere ved højere energi, fordi det udforsker et bredere område af faseloftet, der omfatter i det væsentlige ikke-reaktive konformer. På samme måde foreslår Massey et al. (23) en mulig forklaring på deres konvekse Arrhenius-plot, der involverer to konkurrerende enzymatiske former, som hver især dominerer i et andet temperaturområde. Denne model er et særligt eksempel på en model, der kunne være i overensstemmelse med det modeluafhængige resultat, der præsenteres her. For ikke-biologiske reaktioner forventer vi, at særligt reaktive konfigurationer ofte vil være højenergi-arter. Det er muligt, at konvekse Arrhenius-plots vil være mere almindelige i biologiske systemer, fordi et enzym kan have udviklet sig specifikt således, at de lavenergitilstande (dvs. de mest tilgængelige ved omgivende T) er de reaktive, hvilket fører til lav E̿, selv når T øges.

Konvekse Arrhenius-plots er også blevet observeret for diffusion i underafkølede væsker og glas. Sådanne tilfælde kan, ligesom det ovenfor nævnte hudpermeationsproblem, være kompliceret af flere parallelle veje, men har ikke desto mindre givet anledning til detaljeret analyse. En ofte citeret forklaring er, at molekyler i væsker ved lave temperaturer diffunderer ved at krydse mærkbare potentielle barrierer, mens diffusionsbevægelser ved høje temperaturer er næsten frie (24, 56). Denne model anerkender, at når temperaturen øges, vil de termiske energier blive større i forhold til barrierehøjderne; det, der kræves for et konvekst Arrhenius-plot, er, at den gennemsnitlige energi af molekyler, der foretager overgange (i dette tilfælde diffuse hop fra et lokalt minimum til et andet), stiger langsommere end den gennemsnitlige energi af alle molekyler. Der findes mange detaljerede teorier om ikke-Arrhenius-adfærd i metastable væsker og glas, som ikke eksplicit behandler aktiveringsenergiens temperaturafhængighed i form af Tolmans fortolkning (58), men enhver konsistent forklaring af et konvekst Arrhenius-plot i form af lokale elementære ligevægtshastighedskoefficienter må være i overensstemmelse med Tolmans resultat på et eller andet underliggende niveau, selv om dette ikke er eksplicit eller endog ikke er anerkendt.

Sammenfattende har nærværende artikel påpeget den grundlæggende mikrokanoniske information, som en observation af Arrhenius-plottets konveksitet giver, men som tilsyneladende ikke tidligere er blevet fortolket. Analysen har udbredt anvendelighed og giver en bestemt modeluafhængig forudsigelse om gennemsnitsenergier for systemer, der foretager overgange. Resultatet er relevant for alle kinetiske områder (enzymer, atmosfærekemi, klyngereaktioner osv.), hvor konvekse Arrhenius-plots kan observeres, og vi har derfor holdt præsentationen så generel som muligt, samtidig med at vi citerer nylige eksperimenter med termostabile og mesostabile dehydrogenase- og oxidasekatalysatorer som specifikke eksempler på fænomenet. Vi har også gjort en forbindelse til teorien om diffusion. Vi håber, at det synspunkt, som vi har valgt i denne artikel, vil stimulere til nye måder at tænke reaktionshastigheder, katalyse og diffusion på.

• Modtaget den 12. september 2000.