Convex Arrhenius plots e sua interpretação

Nos últimos anos, um número crescente de estudos tem medido a dependência da temperatura de reações enzimáticas tanto para enzimas termoestáveis quanto para enzimas mesoestáveis (enzimas de organismos que crescem otimamente a altas temperaturas e à temperatura corporal normal, respectivamente). A dependência da temperatura é geralmente exibida em um gráfico de Arrhenius, que é o logaritmo natural do coeficiente de taxa vs. recíproco da temperatura absoluta (Fig. 1). Algumas das metodologias para medir as dependências de temperatura das taxas de reação foram aplicadas para medir as dependências de temperatura dos efeitos isotópicos cinéticos (KIEs) das reações catalisadas também, e tais experimentos fornecem dados experimentais muito relevantes para caracterizar os gargalos dinâmicos das reações (1-6). Um grande número de modelos teóricos foi avançado para a interpretação deste tipo de dados (7-19).

Experimentos sobre reações catalisadas por uma variedade de enzimas desidrogenase e oxidase termoestáveis e mesoestáveis mostraram que em alguns casos o gráfico de Arrhenius para a etapa química é convexo (20-23). No presente trabalho, comentamos o significado desta observação, e fornecemos uma interpretação desta descoberta que a coloca na perspectiva mais ampla da cinética química não biológica, bem como da bioquímica. Este trabalho aponta que o comportamento convexo de Arrhenius coloca uma restrição severa no coeficiente de taxa unimolecular microcanônico para a etapa química. Em particular, podemos ir além da interpretação óbvia de que um traçado convexo de Arrhenius pode ser interpretado como uma taxa inferior à esperada a altas temperaturas, e podemos dizer, sob certas condições, que o coeficiente de taxa unimolecular microcanônica para a etapa química deve realmente diminuir com o aumento da energia.

Em geral, é desejável separar a interpretação dos dados experimentais em duas etapas. Primeiro, inferimos consequências gerais que repousam sobre bases sólidas como a termodinâmica e os princípios gerais da mecânica estatística. Em segundo lugar, procedemos a modelos mais microscopicamente detalhados que repousam em bases menos seguras. O novo aspecto da presente análise está inteiramente relacionado com o primeiro passo.

A característica marcante das reações em refs. 20-23 que discutimos aqui é a convexidade C positiva das suas parcelas Arrhenius, onde 1 k(T) é o coeficiente de taxa catalítica, e T é a temperatura. Escrevemos 2 onde 3 Ea é a energia fenomenológica dependente da temperatura de ativação, e R é a constante gasosa. Assim, uma convexidade positiva significa que Ea diminui com o aumento da temperatura. No vasto campo da cinética, não restringindo a consideração à cinética enzimática, quando se podem observar parcelas não lineares de Arrhenius, elas são quase sempre côncavas, ou seja, C é negativo. Este resultado geral é explicado pela interpretação de Tolman da energia de ativação, que pode ser escrita como (25-27) 4 onde um overbar duplo denota uma média sobre todos os sistemas reagentes, e um overbar único denota uma média sobre todos os sistemas, sejam eles reagentes ou não. Em palavras, o Eq. 4 de Tolman afirma que o negativo da inclinação local de um gráfico Arrhenius pode ser interpretado como igual à energia média das moléculas que reagem menos a energia média de todos os possíveis reagentes. Para reacções unimoleculares de uma espécie termicamente equilibrada: 5 e 6 onde E é a energia total, dP/dE é a densidade de probabilidade normalizada de que um sistema tenha energia E num conjunto canónico à temperatura T, e k(E) é o coeficiente de taxa unimolecular para um conjunto microcanónico à energia E.§ Normalmente, E̿ aumenta mais rapidamente que Ē com o aumento de T porque k(E) é normalmente uma função crescente da energia.¶ Isto explica porque Ea normalmente aumenta com T e, portanto, porque C é negativo. Um gráfico convexo de Arrhenius significa que E̿ diminui ou aumenta menos rapidamente que Ē à medida que a temperatura aumenta, e no parágrafo seguinte argumentamos que isto normalmente implica que k(E) diminui com o aumento da energia sobre a região de energia que domina os integrais em Eq. 6.

Uma pessoa pode fazer uma afirmação mais precisa sobre a consequência de E̿ diminuir ou aumentar menos rapidamente que Ē à medida que a temperatura aumenta. Observando que 7 onde β é 1/RT, e ρ(E) é a densidade de estados, e usando Eqs. 4-6, pode-se facilmente mostrar que 8 Assim a afirmação de que dEa/dT é negativa é a mesma que a afirmação de que a distribuição das energias reacionais é mais estreita do que a distribuição das energias reacionais. Se o dP/dE fosse simétrico em Ē, então o sinal do dEa/dT dependeria da forma da função k(E), e não apenas do seu sinal. Mas o dP/dE é na verdade uma função altamente enviesada. Para moléculas típicas, sua forma é bem aproximada ao definir ρ(E) em Eq. 7 igual a En-1, onde n é aproximadamente igual ao número de graus de liberdade (31). Se assumirmos esta forma e também assumirmos que k(E) varia lenta e linearmente ao longo do importante intervalo dos integrais em Eq. 6, podemos mostrar que o lado direito de Eq. 8 é proporcional a dk/dE com uma constante positiva de proporcionalidade. Para funções k(E) mais complicadas, não há mais proporcionalidade exata, mas a direção do efeito é estabelecida pelo enviesamento positivo do dP/dE. Embora a identidade dos sinais de dEa/dT e dk/dE não seja um teorema matemático, espera-se que se mantenha para densidades normais de estados e funções k(E) suaves.

Este resultado apresenta uma restrição em qualquer interpretação microscópica, e – igualmente importante – sugere novas interpretações microscópicas. Por exemplo, suponha que o espaço de configuração do reagente possa ser dividido em dois tipos de conformações, uma das quais (chamada tipo R) é reativa com coeficiente de taxa kR(E) e a outra (chamada tipo N) é não reativa com coeficiente de taxa zero. Então 9 onde PR(E) é a probabilidade condicional de que um sistema com energia E esteja em uma conformação do tipo R. Isto fornece um mecanismo para k(E) diminuir com E, ou seja, PR(E) diminui com E mais rápido que kR(E) aumenta. Isto pode ocorrer porque os sistemas de maior energia visitam uma região maior de espaço de fase e, portanto, gastam uma fração menor do seu tempo em qualquer região limitada. Esta interpretação pode ser de especial importância para a enzimologia. Nos últimos anos, vários estudos têm se preocupado em compreender o papel da amostragem conformacional na catálise enzimática (17, 18, 22, 32-37). Em uma revisão recente, Bruice e Benkovic (17) argumentaram que as configurações ativas amostradas pelo complexo enzimático não são de maior energia do que a população geral de conformadores e que o povoamento dessas conformações pode determinar a taxa de reação. Em contraste com os modelos às vezes detalhados nos trabalhos citados, a presente interpretação prossegue em bases muito gerais sem invocar nenhum mecanismo ou modelo molecular microscópico particular, como o tunelamento promovido por flutuações de enzimas termicamente excitadas (11, 13, 38, 39), energia livre de cálculos de ativação incluindo amostra apropriada sobre conformações (40), ou mecanismos específicos de transições entre microstatos de flexibilidade conformacional variável (41-44). No entanto, ele pode claramente acomodar interpretações mais específicas, como uma proteína rígida em T baixo ou um movimento dinâmico que requer população de estados vibracionais específicos de baixa energia. No entanto, nada do que aqui dissemos dá suporte específico a tais modelos, cuja validade deve ser examinada por mais experiências e simulações detalhadas. A presente discussão não invoca especificamente efeitos associados com a quebra da teoria dos estados de transição. Efeitos quânticos como a tunelização podem ser acomodados simplesmente incluindo-os em k(E) ou kR(E).

No contexto de nossa análise, os resultados mencionados acima para a termopilha álcool desidrogenase ADH-hT (22, 32) podem ser interpretados em termos das tendências relativas em E̿ e Ē quando a temperatura é alterada. Uma hipótese amplamente avançada é que as enzimas termofílicas evoluíram para funcionar em seu nicho fisiológico, ou seja, em temperatura elevada, e são menos ativas à temperatura ambiente (ainda menos ativas, em alguns casos, do que o previsto por sua entalpia de ativação à temperatura fisiológica). Nossa análise pode oferecer uma conexão entre essa noção e os cálculos relativos à identificação de conformações ativas e não-ativas (16, 17). Por exemplo, Wrba et al. (21) relataram uma observação empírica que, para enzimas com diferentes temperaturas de fusão, a diferença nas temperaturas de curvatura máxima nas parcelas de Arrhenius é semelhante à diferença na temperatura de fusão. Isto pode estar relacionado a mudanças nas dependências de PR(E) e kR(E) de E nas faixas que são importantes nas temperaturas de transição para desnaturação e atividade. Como exemplo adicional, notamos que foi recentemente sugerido que “talvez não seja surpreendente que, para as reações de clivagem da ligação C-H, uma partição da energia térmica em modos de proteína de baixa freqüência seja um fator importante”. Estes modos podem ficar significativamente excitados à temperatura ambiente, em contraste com o modo de estiramento C-H, que se espera que esteja em grande parte confinado ao seu nível de energia de ponto zero” (22). Este tipo de considerações pode estar relacionado à dependência da temperatura de E̿ e Ē e, portanto, à concavidade ou convexidade das parcelas de Arrhenius.

A conclusão geral sobre a dependência energética do coeficiente da taxa microcanônica também é aplicável às parcelas de Arrhenius convexa que são ocasionalmente observadas em outros estudos. Para aplicar estes argumentos, deve-se ter cuidado para assegurar que o gráfico de Arrhenius convexo representa uma verdadeira reação elementar com reagentes internamente equilibrados. Por exemplo, no protótipo problema de estado estacionário 10 onde 11 com 12 pode ser aplicado a k1, k-1, ou k2, mas não geralmente a k. Entretanto, se k-1 e k1 são muito maiores que k2, então k torna-se um coeficiente de taxa elementar para A → C, e nenhuma conclusão é alterada pelo pré-equilíbrio antes da etapa de determinação da taxa. Isto aplica-se ainda ao caso em que k2 é muito maior do que k1 e k-1, em que k se torna k1. Um caso especial em que a abordagem de estado estacionário pode ser aplicada é aquele em que A corresponde ao reagente e enzima não ligados, estado B é o complexo de Michaelis, e estado C é o produto (45). Note que neste caso k1 (em Eq. 12) deve ser uma constante de segunda ordem que leva à equação de Michaelis: 13 onde está a concentração do reagente (substrato), Vmax é a taxa de reação a muito maior que KM, que é a constante de Michaelis, (k2 + k-1)/k1, para Eq. 10. A discussão não se aplica a coeficientes de taxa efetiva resultantes de uma mudança na etapa determinante da taxa ou a mudanças na concentração efetiva da enzima, nem se aplica a coeficientes de taxa com histerese atribuível à formação de vidro. Este ponto deve ser enfatizado para as reações enzimáticas: as taxas medidas representam de fato uma constante de taxa consistente significativa em toda a faixa de temperatura? Por exemplo, em um relatório antecipado da trama convexa de Arrhenius para a álcool termófila desidrogenase do Bacillus stearothermophilus (ADH-hT), todas as medições foram realizadas com a mesma concentração do substrato (que estava saturando a enzima à temperatura ambiente), e Vmax foi apresentado (47). Um relatório posterior (22) descobriu que o KM aumenta com a temperatura de tal forma que a alta temperatura não era suficientemente maior que KM, e a taxa medida foi encontrada mais lenta que Vmax, apresentando um gráfico aparentemente convexo de Arrhenius. Mesmo para a mais simples cinética enzimática realista, o mecanismo 10 deve ser aumentado por uma etapa de liberação do produto, e os dados devem ser analisados com a devida consideração pelo compromisso com a catálise e a razão de catálise (48, 49); caso contrário, o kcat medido pode mostrar uma dependência de temperatura diferente do k2 intrínseco. As Refs. 20-24 foram selecionadas como exemplos onde foi tomado especial cuidado para assegurar e demonstrar que o gráfico de Arrhenius corresponde a uma única etapa elementar de reação química limitadora de taxa como função da temperatura. Rubach e Plapp (comunicação pessoal de resultados não publicados), por exemplo, utilizaram técnicas de estado pré-estabelecido de fluxo parado para medir KIEs em constantes de taxa microscópica para estudar a reação catalisada pela álcool desidrogenase hepática de cavalo. Encontraram parcelas convexas de Arrhenius tanto para a transferência de hidreto como para a transferência de deuterido, mas sem dependência da temperatura das KIEs, e demonstraram que nenhuma alteração na etapa determinante da taxa era susceptível de afectar os seus resultados. Excluímos ainda os casos em que a faixa de temperatura permite o derretimento irreversível ou parcial da proteína fundida. Em contraste com os exemplos enzimáticos mostrando comportamento convexo de Arrhenius envolvendo uma única etapa elementar, mencionamos o caso de permeação cutânea de drogas, onde o comportamento convexo de Arrhenius foi observado, mas onde as etapas elementares não foram ou não podem ser resolvidas (50, 51). Para comparação com a permeação através da pele, mencionamos também que o caso um pouco mais bem definido de dependência da temperatura não-Arrhenius da difusão em sólidos amorfos foi modelado por um modelo de múltiplo passo local (52, 53).

Um exemplo da química orgânica fornece uma ilustração útil desses conceitos em conjunto com uma reorganização estrutural dependente da temperatura. Limbach observou parcelas convexas de Arrhenius (comunicação pessoal de resultados não publicados) para a transferência de prótons intramoleculares base-catalizada em 1,3-bis-(4-fluorofenil)-triazeno dissolvido em éter etílico metílico. O coeficiente de taxa representa uma média sobre diferentes formas de hidrogênio ligado do reagente, especialmente a molécula livre e o complexo com base. A transferência do próton ocorre no complexo. A curvatura convexa de Arrhenius surge do facto de a molécula mudar a alta temperatura para a forma não complexada onde a barreira à transferência de protões é maior (ref. 55 e H. H. Limbach, comunicação pessoal). Assim, a interpretação de Tolman não se aplica estritamente porque o coeficiente de taxa não representa uma única etapa elementar. A trama Arrhenius da reação de uma das formas separadamente seria presumivelmente quasilinear ou côncava. Se, no entanto, as diferentes formas ligadas ao hidrogênio forem consideradas como sendo conformantes de um único reagente, a interpretação de Tolman pode ser aplicada, e ela fornece uma ilustração de uma molécula que reage mais lentamente a uma energia mais elevada porque explora uma região mais ampla do espaço de fase que inclui essencialmente conformantes não reativos. Da mesma forma, Massey et al. (23) sugerem uma possível explicação de sua trama convexa de Arrhenius envolvendo duas formas enzimáticas concorrentes, cada uma dominando em uma faixa de temperatura diferente. Este modelo é um exemplo particular de um modelo que poderia ser consistente com o resultado independente do modelo aqui apresentado. Para reacções nãobiológicas esperamos que as configurações particularmente reactivas sejam frequentemente espécies de alta energia. É possível que parcelas convexas de Arrhenius sejam mais comuns em sistemas biológicos porque uma enzima pode ter evoluído especificamente de tal forma que os estados de menor energia (i.e., os mais acessíveis em T ambiente) são os reactivos, levando assim a baixos E̿ mesmo quando T é aumentado.

Convex As parcelas de Arrhenius também foram observadas para difusão em líquidos super-refrigerados e vidros. Tais casos, como o problema de permeação cutânea mencionado acima, podem ser complicados por múltiplas vias paralelas, mas mesmo assim cederam a uma análise detalhada. Uma explicação amplamente citada é que moléculas em líquidos de baixa temperatura se difundem atravessando barreiras potenciais apreciáveis, enquanto que em alta temperatura, os movimentos difusivos são quase livres (24, 56). Este modelo reconhece que à medida que a temperatura é elevada, as energias térmicas tornar-se-ão maiores em comparação com as alturas de barreira; o que é necessário para um gráfico convexo de Arrhenius é que a energia média das moléculas fazendo transições (neste caso, lúpulo difusivo de um mínimo local para outro) aumenta mais lentamente do que a energia média de todas as moléculas. Existem muitas teorias detalhadas sobre o comportamento não-Arrhenius em fluidos e óculos metastáveis que não abordam explicitamente a dependência da temperatura da energia de ativação em termos da interpretação de Tolman (58), mas qualquer explicação consistente de um gráfico de Arrhenius convexo em termos de coeficientes de taxa elementar de equilíbrio local deve ser consistente com o resultado de Tolman em algum nível subjacente, mesmo que isto não seja explícito ou nem mesmo reconhecido.

Em resumo, o presente artigo apontou a informação microcanônica fundamental que é fornecida por uma observação da convexidade do gráfico de Arrhenius, mas que aparentemente não foi interpretada anteriormente. A análise tem ampla aplicabilidade e faz uma previsão definitiva, independente do modelo, sobre as energias médias dos sistemas que fazem as transições. O resultado é relevante para todos os campos da cinética (em enzimas, em química atmosférica, em reações em cluster, etc.) onde gráficos convexos de Arrhenius podem ser observados, e por isso temos mantido a apresentação o mais geral possível, enquanto citamos experiências recentes com catalisadores termoestáveis e mesoestáveis de desidrogenase e oxidase como exemplos específicos exibindo o fenômeno. Também fizemos uma conexão com a teoria da difusão. Esperamos que o ponto de vista defendido neste artigo estimule novas formas de pensar sobre taxas de reação, catálise e difusão.

• Recebido em 12 de setembro de 2000.