Le metiltransferasi del DNA (MTasi) che trasferiscono un gruppo metile dalla S-adenosilmetionina ai residui di adenina o citosina, si trovano in una grande varietà di procarioti ed eucarioti. La metilazione dovrebbe essere considerata quando si digerisce il DNA con le endonucleasi di restrizione perché la scissione può essere bloccata o compromessa quando una particolare base nel sito di riconoscimento è metilata.
Metilazione procariotica
Nei procarioti, le MTasi sono state spesso identificate come elementi di sistemi di restrizione/modificazione che agiscono per proteggere il DNA ospite dalla scissione della corrispondente endonucleasi di restrizione. La maggior parte dei ceppi di laboratorio di E. coli contiene tre DNA metilasi site-specific.
- Dam metilasi-metilazione in posizione N6 dell’adenina nella sequenza GATC (1,2).
- Dcm metiltransferasi-metilazione in posizione C5 della seconda citosina nelle sequenze CCAGG e CCTGG (1,3).
- EcoKI metilasi-metilazione dell’adenina nelle sequenze AAC(N6)GTGC e GCAC(N6)GTT.
Alcuni o tutti i siti per un’endonucleasi di restrizione possono essere resistenti alla scissione quando isolati da ceppi che esprimono le metilasi Dam o Dcm se il sito di riconoscimento della metilasi si sovrappone a quello dell’endonucleasi. Per esempio, il DNA plasmidico isolato da E. coli dam+ è completamente resistente alla scissione di MboI, che scinde i siti GATC.
Non tutto il DNA isolato da E. coli è metilato nella stessa misura. Mentre il DNA pBR322 è completamente modificato (ed è quindi completamente resistente alla digestione di MboI), solo circa il 50% dei siti Dam del DNA λ sono metilati, presumibilmente perché la metilasi non ha l’opportunità di metilare completamente il DNA prima che sia impacchettato nella testa del fago. Di conseguenza, gli enzimi bloccati dalla modifica Dam o Dcm produrranno modelli di digestione parziale con il DNA λ.
I siti di restrizione che sono bloccati dalla metilazione Dam o Dcm possono essere desmetilati clonando il tuo DNA in un ceppo dam-, dcm- di E. coli, come dam-/dcm- E. coli competente (NEB #C2925).
I siti di restrizione possono anche essere bloccati se è presente un sito sovrapposto. In questo caso, parte della sequenza Dam o Dcm è generata dalla sequenza dell’enzima di restrizione, seguita dalla sequenza fiancheggiatrice. Anche questa situazione dovrebbe essere considerata quando si progettano digest degli enzimi di restrizione.
Metilazione eucariotica
Le metilasi CpG, presenti negli eucarioti superiori (ad esempio, Dnmt1), trasferiscono un gruppo metile alla posizione C5 dei residui di citosina. I modelli di metilazione CpG sono ereditabili, specifici del tessuto e correlati all’espressione genica. Di conseguenza, la metilazione CpG è stata postulata per svolgere un ruolo nella differenziazione e nell’espressione genica (4).
Nota: Gli effetti della metilazione CpG sono principalmente una preoccupazione quando si digerisce il DNA genomico eucariotico. I modelli di metilazione CpG non vengono mantenuti una volta che il DNA viene clonato in un ospite batterico.
Sensibilità alla metilazione
La tabella sottostante riassume la sensibilità alla metilazione per gli enzimi di restrizione NEB, indicando se il clivaggio è bloccato o compromesso dalla metilazione Dam, Dcm o CpG se o quando si sovrappone ad ogni sito di riconoscimento. Questa tabella dovrebbe essere vista come una guida al comportamento degli enzimi elencati piuttosto che un indicatore assoluto. Consultare REBASE, il database degli enzimi di restrizione, per informazioni più dettagliate ed esempi specifici su cui si basano queste linee guida.
- Marinus, M.G. and Morris, N.R. (1973) J. Bacteriol. 114, 1143-1150. PMID: 4576399
- Geier, G.E.and Modrich, P. (1979) J. Biol. Chem. 254, 1408-1413. PMID: 368070
- May, M.S. and Hattman, S.(1975) J. Bacteriol. 123, 768-770. PMID: 1097428
- Siegfried, Z. and Cedar, H. (1997) Curr. Biol. 7, r305-307. PMID: 9115385
Legenda
| ● | Non sensibile | ◆ | Impiegato |
| ◼ | Bloccato | ◇ ol | Impedito dalla sovrapposizione |
| ◻ ol | Bloccato dalla sovrapposizione | ◇ scol | Impedito da alcune combinazioni di sovrapposizione |
| ◻ scol | Bloccato da alcune combinazioni di sovrapposizione | ||
Codice a lettera singola