Konvexe Arrhenius-Plots und ihre Interpretation

In den letzten Jahren wurde in einer zunehmenden Zahl von Studien die Temperaturabhängigkeit von Enzymreaktionen sowohl für thermostabile als auch für mesostabile Enzyme (Enzyme aus Organismen, die optimal bei hoher Temperatur bzw. bei normaler Körpertemperatur wachsen) gemessen. Die Temperaturabhängigkeit wird in der Regel in einem Arrhenius-Diagramm dargestellt, das den natürlichen Logarithmus des Geschwindigkeitskoeffizienten gegen den Kehrwert der absoluten Temperatur darstellt (Abb. 1). Einige der Methoden zur Messung der Temperaturabhängigkeit von Reaktionsgeschwindigkeiten wurden auch zur Messung der Temperaturabhängigkeit der kinetischen Isotopeneffekte (KIEs) der katalysierten Reaktionen angewandt, und solche Experimente liefern experimentelle Daten, die für die Charakterisierung der dynamischen Engpässe der Reaktionen sehr wichtig sind (1-6). Für die Interpretation dieser Art von Daten wurde eine Vielzahl theoretischer Modelle entwickelt (7-19).

Experimente an Reaktionen, die von einer Vielzahl thermostabiler und mesostabiler Dehydrogenase- und Oxidase-Enzyme katalysiert werden, haben gezeigt, dass in einigen Fällen das Arrhenius-Diagramm für den chemischen Schritt konvex ist (20-23). In der vorliegenden Arbeit kommentieren wir die Bedeutung dieser Beobachtung und geben eine Interpretation dieses Ergebnisses, die es in die breitere Perspektive der nichtbiologischen chemischen und biochemischen Kinetik stellt. In diesem Beitrag wird darauf hingewiesen, dass das konvexe Arrhenius-Verhalten den mikrokanonischen unimolekularen Ratenkoeffizienten für den chemischen Schritt stark einschränkt. Insbesondere können wir über die offensichtliche Interpretation hinausgehen, dass ein konvexer Arrhenius-Plot als eine niedrigere als die erwartete Rate bei hohen Temperaturen interpretiert werden kann, und wir können unter bestimmten Bedingungen sagen, dass der mikrokanonische unimolekulare Ratenkoeffizient für den chemischen Schritt tatsächlich mit zunehmender Energie abnehmen muss.

Im Allgemeinen ist es wünschenswert, die Interpretation experimenteller Daten in zwei Schritten zu trennen. Zunächst leiten wir allgemeine Konsequenzen ab, die auf soliden Grundlagen wie der Thermodynamik und allgemeinen Prinzipien der statistischen Mechanik beruhen. Zweitens gehen wir zu mikroskopisch detaillierteren Modellen über, die auf weniger sicheren Füßen stehen. Der neue Aspekt der vorliegenden Analyse befasst sich ausschließlich mit dem ersten Schritt.

Das auffällige Merkmal der Reaktionen in refs. 20-23, die wir hier diskutieren, ist die positive Konvexität C ihrer Arrhenius-Plots, wobei 1 k(T) der katalytische Ratenkoeffizient und T die Temperatur ist. Wir schreiben 2 wobei 3 Ea die temperaturabhängige phänomenologische Aktivierungsenergie und R die Gaskonstante ist. Eine positive Konvexität bedeutet also, dass Ea mit steigender Temperatur abnimmt. Im weiten Feld der Kinetik, das sich nicht auf die Enzymkinetik beschränkt, sind nichtlineare Arrhenius-Diagramme fast immer konkav, d. h. C ist negativ. Dieses allgemeine Ergebnis wird durch Tolmans Interpretation der Aktivierungsenergie erklärt, die als (25-27) 4 geschrieben werden kann, wobei ein doppelter Balken einen Durchschnitt über alle reagierenden Systeme bezeichnet und ein einfacher Balken einen Durchschnitt über alle Systeme, unabhängig davon, ob sie reagieren oder nicht. Tolmans Gleichung 4 besagt, dass das Negativ der lokalen Steigung einer Arrhenius-Kurve gleich der durchschnittlichen Energie der reagierenden Moleküle abzüglich der durchschnittlichen Energie aller möglichen Reaktanten ist. Für unimolekulare Reaktionen einer thermisch im Gleichgewicht befindlichen Spezies: 5 und 6 wobei E die Gesamtenergie ist, dP/dE die normierte Wahrscheinlichkeitsdichte, dass ein System in einem kanonischen Ensemble bei der Temperatur T die Energie E hat, und k(E) der unimolekulare Geschwindigkeitskoeffizient für ein mikrokanonisches Ensemble bei der Energie E ist.§ In der Regel nimmt E̿ mit zunehmendem T schneller zu als Ē, da k(E) in der Regel eine zunehmende Funktion der Energie ist. Dies erklärt, warum Ea in der Regel mit T zunimmt und daher C negativ ist. Ein konvexes Arrhenius-Diagramm bedeutet, dass E̿ mit zunehmender Temperatur abnimmt oder weniger schnell als Ē zunimmt, und im nächsten Abschnitt argumentieren wir, dass dies normalerweise bedeutet, dass k(E) mit zunehmender Energie in dem Energiebereich abnimmt, der die Integrale in Gl. 6 dominiert.

Man kann eine genauere Aussage über die Folge machen, dass E̿ mit zunehmender Temperatur weniger schnell als Ē abnimmt oder zunimmt. Wenn man feststellt, dass 7, wobei β 1/RT und ρ(E) die Zustandsdichte ist, und wenn man die Gleichungen 4-6 verwendet, kann man leicht zeigen, dass 8 Die Aussage, dass dEa/dT negativ ist, ist also gleichbedeutend mit der Aussage, dass die Verteilung der Reaktionsenergien schmaler ist als die Verteilung der Reaktantenergien. Wäre dP/dE symmetrisch um Ē, dann würde das Vorzeichen von dEa/dT von der Form der Funktion k(E) abhängen, und nicht nur von ihrem Vorzeichen. Aber dP/dE ist tatsächlich eine stark schiefe Funktion. Für typische Moleküle lässt sich ihre Form gut annähern, indem man ρ(E) in Gl. 7 gleich En-1 setzt, wobei n ungefähr gleich der Anzahl der Freiheitsgrade ist (31). Wenn man diese Form annimmt und außerdem davon ausgeht, dass k(E) langsam und linear über den wichtigen Bereich der Integrale in Gl. 6 variiert, kann man zeigen, dass die rechte Seite von Gl. 8 proportional zu dk/dE mit einer positiven Proportionalitätskonstante ist. Für kompliziertere k(E)-Funktionen besteht keine exakte Proportionalität mehr, aber die Richtung des Effekts wird durch die positive Schräglage von dP/dE bestimmt. Obwohl die Identität der Vorzeichen von dEa/dT und dk/dE kein mathematisches Theorem ist, wird erwartet, dass sie für normale Zustandsdichten und glatte k(E)-Funktionen gilt.

Dieses Ergebnis stellt eine Einschränkung für jede mikroskopische Interpretation dar, und – was ebenso wichtig ist – es legt neue mikroskopische Interpretationen nahe. Nehmen wir zum Beispiel an, dass der Konfigurationsraum des Reaktanten in zwei Arten von Konformationen unterteilt werden kann, von denen eine (genannt Typ R) reaktiv ist mit dem Ratenkoeffizienten kR(E) und die andere (genannt Typ N) nicht reaktiv ist mit dem Ratenkoeffizienten Null. Dann 9 ist PR(E) die bedingte Wahrscheinlichkeit, dass sich ein System mit der Energie E in einer Konformation des Typs R befindet. Dies bietet einen Mechanismus, mit dem k(E) mit E abnimmt, d. h. PR(E) nimmt mit E schneller ab als kR(E) zunimmt. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass Systeme mit höherer Energie eine größere Region des Phasenraums besuchen und daher einen geringeren Anteil ihrer Zeit in einer einzelnen eingeschränkten Region verbringen. Diese Interpretation könnte für die Enzymologie von besonderer Bedeutung sein. In den letzten Jahren haben sich mehrere Studien damit beschäftigt, die Rolle des Konformations-Samplings bei der Enzymkatalyse zu verstehen (17, 18, 22, 32-37). In einer kürzlich erschienenen Übersichtsarbeit argumentieren Bruice und Benkovic (17), dass die aktiven Konfigurationen, die vom enzymatischen Komplex abgetastet werden, keine höhere Energie aufweisen als die allgemeine Population von Konformeren und dass die Besetzung dieser Konformationen die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmen kann. Im Gegensatz zu den manchmal detaillierten Modellen in den zitierten Arbeiten geht die vorliegende Interpretation von sehr allgemeinen Grundlagen aus, ohne sich auf einen bestimmten mikroskopischen molekularen Mechanismus oder ein bestimmtes Modell zu berufen, wie z. B. Tunneling, das durch thermisch angeregte Enzymfluktuationen gefördert wird (11, 13, 38, 39), Berechnungen der freien Aktivierungsenergie, die eine angemessene Stichprobe über die Konformationen einschließen (40), oder spezifische Mechanismen von Übergängen zwischen Mikrozuständen mit unterschiedlicher konformationeller Flexibilität (41-44). Nichtsdestotrotz können auch spezifischere Interpretationen berücksichtigt werden, wie z. B. ein Protein, das bei niedrigem T starr ist, oder eine dynamische Bewegung, die die Besiedlung bestimmter Schwingungszustände mit niedriger Energie erfordert. Wir haben hier jedoch nichts gesagt, was solche Modelle konkret unterstützt, deren Gültigkeit durch weitere Experimente und detaillierte Simulationen untersucht werden sollte. Die vorliegende Diskussion bezieht sich nicht speziell auf Effekte, die mit dem Zusammenbruch der Theorie der Übergangszustände verbunden sind. Quanteneffekte wie das Tunneln können berücksichtigt werden, indem man sie einfach in k(E) oder kR(E) einbezieht.

Im Rahmen unserer Analyse können die oben erwähnten Ergebnisse für die thermophile Alkoholdehydrogenase ADH-hT (22, 32) in Bezug auf die relativen Trends in E̿ und Ē bei Temperaturänderungen interpretiert werden. Eine weit verbreitete Hypothese besagt, dass thermophile Enzyme sich so entwickelt haben, dass sie in ihrer physiologischen Nische, d. h. bei erhöhter Temperatur, funktionieren und bei Raumtemperatur weniger aktiv sind (in einigen Fällen sogar weniger aktiv, als ihre Aktivierungsenthalpie bei physiologischer Temperatur erwarten lässt). Unsere Analyse kann eine Verbindung zwischen dieser Vorstellung und Berechnungen zur Identifizierung aktiver und nicht aktiver Konformationen herstellen (16, 17). Wrba et al. (21) berichteten beispielsweise über die empirische Beobachtung, dass bei Enzymen mit unterschiedlichen Schmelztemperaturen der Unterschied bei den Temperaturen der maximalen Krümmung in Arrhenius-Diagrammen dem Unterschied bei der Schmelztemperatur entspricht. Dies könnte mit Verschiebungen der PR(E)- und kR(E)-Abhängigkeiten von E in den Bereichen zusammenhängen, die bei den Übergangstemperaturen für die Denaturierung und Aktivität wichtig sind. Als zusätzliches Beispiel weisen wir darauf hin, dass kürzlich vorgeschlagen wurde, dass es „vielleicht nicht überraschend ist, dass bei C-H-Bindungsspaltungsreaktionen eine Aufteilung der thermischen Energie in niederfrequente Proteinmoden ein wichtiger Faktor ist. Diese Moden können bei Umgebungstemperatur erheblich angeregt werden, im Gegensatz zur C-H-Streckungsmode, von der man erwartet, dass sie weitgehend auf ihr Nullpunktenergieniveau beschränkt ist“ (22). Derartige Überlegungen können mit der Temperaturabhängigkeit von E̿ und Ē und damit mit der Konkavität oder Konvexität von Arrhenius-Plots in Verbindung gebracht werden.

Die allgemeine Schlussfolgerung über die Energieabhängigkeit des mikrokanonischen Geschwindigkeitskoeffizienten gilt auch für konvexe Arrhenius-Plots, die gelegentlich in anderen Studien beobachtet werden. Wenn man diese Argumente anwendet, muss man darauf achten, dass das konvexe Arrhenius-Diagramm eine echte Elementarreaktion mit intern im Gleichgewicht befindlichen Reaktanten darstellt. Beim prototypischen Steady-State-Problem 10 mit 11 und 12 kann sie beispielsweise auf k1, k-1 oder k2 angewandt werden, aber nicht generell auf k. Wenn jedoch k-1 und k1 viel größer als k2 sind, dann wird k zu einem elementaren Ratenkoeffizienten für A → C, und die Schlussfolgerungen werden durch das Vorgleichgewicht vor dem ratenbestimmenden Schritt nicht verändert. Dies gilt auch für den Fall, dass k2 sehr viel größer ist als k1 und k-1, wo k zu k1 wird. Ein spezieller Fall, in dem der Steady-State-Ansatz angewendet werden kann, ist der, in dem A dem ungebundenen Reaktanten und Enzym entspricht, Zustand B der Michaelis-Komplex und Zustand C das Produkt ist (45). Man beachte, dass in diesem Fall k1 (in Gl. 12) eine Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung sein sollte, die zu der Michaelis-Gleichung führt: 13 wobei die Konzentration des Reaktanten (Substrats) ist, Vmax die Reaktionsgeschwindigkeit bei einem viel höheren Wert als KM, der die Michaelis-Konstante, (k2 + k-1)/k1, für Gleichung 10 ist. Die Diskussion gilt nicht für effektive Geschwindigkeitskoeffizienten, die sich aus einer Änderung des geschwindigkeitsbestimmenden Schritts oder aus Änderungen der effektiven Enzymkonzentration ergeben, und auch nicht für Geschwindigkeitskoeffizienten mit Hysterese, die auf Glasbildung zurückzuführen ist. Dieser Punkt sollte bei enzymatischen Reaktionen hervorgehoben werden: Stellen die gemessenen Raten tatsächlich eine aussagekräftige, konsistente Ratenkonstante über den gesamten Temperaturbereich dar? In einem frühen Bericht über eine konvexe Arrhenius-Kurve für die thermophile Alkoholdehydrogenase aus Bacillus stearothermophilus (ADH-hT) wurden beispielsweise alle Messungen mit der gleichen Substratkonzentration durchgeführt (die das Enzym bei Raumtemperatur sättigte), und es wurde Vmax angegeben (47). In einem späteren Bericht (22) wurde festgestellt, dass KM mit der Temperatur ansteigt, so dass die gemessene Geschwindigkeit bei hoher Temperatur nicht ausreichend größer als KM war, und die gemessene Geschwindigkeit war langsamer als Vmax, was ein scheinbar konvexes Arrhenius-Diagramm ergab. Selbst für die einfachste realistische Enzymkinetik sollte der Mechanismus 10 durch einen Produktfreisetzungsschritt ergänzt werden, und die Daten sollten unter Berücksichtigung der Katalyseverpflichtung und des Katalyseverhältnisses analysiert werden (48, 49); andernfalls kann das gemessene kcat eine andere Temperaturabhängigkeit aufweisen als das intrinsische k2. Die Referenzen 20-24 wurden als Beispiele ausgewählt, bei denen besonders darauf geachtet wurde, dass das Arrhenius-Diagramm einem einzigen geschwindigkeitsbegrenzenden elementaren chemischen Reaktionsschritt als Funktion der Temperatur entspricht. Rubach und Plapp (persönliche Mitteilung unveröffentlichter Ergebnisse) verwendeten beispielsweise Techniken mit gestoppter Strömung und vorstationärem Zustand zur Messung von KIEs an mikroskopischen Geschwindigkeitskonstanten, um die von der Alkoholdehydrogenase der Pferdeleber katalysierte Reaktion zu untersuchen. Sie fanden konvexe Arrhenius-Diagramme sowohl für den Hydrid- als auch für den Deuterid-Transfer, aber keine Temperaturabhängigkeit der KIEs, und sie wiesen nach, dass keine Änderung des geschwindigkeitsbestimmenden Schritts ihre Ergebnisse beeinflussen dürfte. Außerdem haben wir Fälle ausgeschlossen, bei denen der Temperaturbereich irreversibel geschmolzenes oder teilweise geschmolzenes Protein zulässt. Im Gegensatz zu den enzymatischen Beispielen, die ein konvexes Arrhenius-Verhalten mit einem einzigen elementaren Schritt zeigen, erwähnen wir den Fall der Permeation von Arzneimitteln durch die Haut, bei dem ein konvexes Arrhenius-Verhalten beobachtet wurde, bei dem aber die elementaren Schritte nicht aussortiert wurden oder werden können (50, 51). Zum Vergleich mit der Permeation durch die Haut erwähnen wir auch, dass der etwas besser definierte Fall der Nicht-Arrhenius-Temperaturabhängigkeit der Diffusion in amorphen Festkörpern durch ein mehrstufiges Site-Hopping-Modell modelliert wurde (52, 53).

Ein Beispiel aus der organischen Chemie liefert eine nützliche Illustration dieser Konzepte in Verbindung mit einer temperaturabhängigen strukturellen Reorganisation. Limbach hat konvexe Arrhenius-Plots (persönliche Mitteilung unveröffentlichter Ergebnisse) für den basenkatalysierten intramolekularen Protonentransfer in 1,3-Bis-(4-fluorphenyl)-triazen, gelöst in Ethylmethylether, beobachtet. Der Geschwindigkeitskoeffizient ist ein Durchschnittswert für verschiedene wasserstoffgebundene Formen des Reaktanten, insbesondere für das freie Molekül und den Komplex mit der Base. Der Protonentransfer findet im Komplex statt. Die konvexe Arrhenius-Krümmung ergibt sich aus der Tatsache, dass das Molekül bei hoher Temperatur in die nicht-komplexierte Form übergeht, in der die Barriere für den Protonentransfer größer ist (Ref. 55 und H. H. Limbach, persönliche Mitteilung). Daher ist die Tolman-Interpretation nicht unbedingt zutreffend, da der Geschwindigkeitskoeffizient nicht einen einzelnen elementaren Schritt darstellt. Das Arrhenius-Diagramm der Reaktion für jede der beiden Formen würde vermutlich quasilinear oder konkav sein. Wenn jedoch die verschiedenen wasserstoffgebundenen Formen als Konformer eines einzigen Reaktanten betrachtet werden, kann die Tolman-Interpretation angewandt werden, die ein Molekül veranschaulicht, das bei höherer Energie langsamer reagiert, weil es einen größeren Bereich des Phasenraums erkundet, der im Wesentlichen nicht reaktive Konformer umfasst. In ähnlicher Weise schlagen Massey et al. (23) eine mögliche Erklärung für ihr konvexes Arrhenius-Diagramm vor, das zwei konkurrierende enzymatische Formen beinhaltet, die jeweils in einem anderen Temperaturbereich dominieren. Dieses Modell ist ein besonderes Beispiel für ein Modell, das mit dem hier vorgestellten modellunabhängigen Ergebnis vereinbar sein könnte. Bei nichtbiologischen Reaktionen erwarten wir, dass besonders reaktive Konfigurationen oft hochenergetische Spezies sind. Es ist möglich, dass konvexe Arrhenius-Diagramme in biologischen Systemen häufiger vorkommen, weil sich ein Enzym speziell so entwickelt haben könnte, dass die Zustände mit der niedrigsten Energie (d. h. die bei Umgebungstemperatur T am leichtesten zugänglichen) die reaktiven sind, was zu einem niedrigen E̿ führt, selbst wenn T erhöht wird.

Konvexe Arrhenius-Diagramme wurden auch für die Diffusion in unterkühlten Flüssigkeiten und Gläsern beobachtet. Solche Fälle, wie das oben erwähnte Hautpermeationsproblem, können durch mehrere parallele Pfade kompliziert sein, haben sich aber dennoch einer detaillierten Analyse unterzogen. Eine weit verbreitete Erklärung ist, dass Moleküle in Flüssigkeiten bei niedrigen Temperaturen diffundieren, indem sie beträchtliche Potenzialbarrieren überwinden, während bei hohen Temperaturen die Diffusionsbewegungen nahezu frei sind (24, 56). Dieses Modell erkennt an, dass mit steigender Temperatur die thermischen Energien im Vergleich zur Höhe der Barrieren größer werden. Voraussetzung für eine konvexe Arrhenius-Kurve ist, dass die durchschnittliche Energie der Moleküle, die Übergänge machen (in diesem Fall diffusive Sprünge von einem lokalen Minimum zu einem anderen), langsamer ansteigt als die durchschnittliche Energie aller Moleküle. Es gibt viele detaillierte Theorien des Nicht-Arrhenius-Verhaltens in metastabilen Flüssigkeiten und Gläsern, die die Temperaturabhängigkeit der Aktivierungsenergie im Sinne der Tolman-Interpretation nicht explizit berücksichtigen (58), aber jede konsistente Erklärung eines konvexen Arrhenius-Diagramms im Sinne von lokalen Gleichgewichts-Elementarkoeffizienten muss auf einer zugrunde liegenden Ebene mit dem Tolman-Ergebnis übereinstimmen, auch wenn dies nicht explizit ist oder nicht einmal erkannt wird.

Zusammenfassend hat der vorliegende Artikel die grundlegende mikrokanonische Information aufgezeigt, die sich aus der Beobachtung der Konvexität des Arrhenius-Plots ergibt, die aber offenbar bisher nicht interpretiert wurde. Die Analyse ist weithin anwendbar und macht eine eindeutige, modellunabhängige Vorhersage über die durchschnittlichen Energien von Systemen, die Übergänge machen. Das Ergebnis ist für alle Bereiche der Kinetik (Enzyme, Atmosphärenchemie, Clusterreaktionen usw.) relevant, in denen konvexe Arrhenius-Plots beobachtet werden können. Daher haben wir die Darstellung so allgemein wie möglich gehalten, während wir aktuelle Experimente mit thermostabilen und mesostabilen Dehydrogenase- und Oxidase-Katalysatoren als spezifische Beispiele für dieses Phänomen anführen. Wir haben auch eine Verbindung zur Theorie der Diffusion hergestellt. Wir hoffen, dass der in dieser Arbeit vertretene Standpunkt zu neuen Überlegungen über Reaktionsgeschwindigkeiten, Katalyse und Diffusion anregt.

• Eingegangen am 12. September 2000.