Il metodo Sanger viene utilizzato per amplificare un segmento di DNA bersaglio, in modo da poter determinare con precisione la sequenza del DNA. L’incorporazione di ddNTP nelle valvole di reazione servono semplicemente a terminare la sintesi di un filamento di DNA in crescita, ottenendo frammenti di DNA parzialmente replicati. Questo perché la DNA polimerasi richiede il gruppo 3′ OH della catena in crescita e il gruppo 5′ fosfato del dNTP in arrivo per creare un legame fosfodiestere. A volte la DNA polimerasi incorporerà un ddNTP e l’assenza del gruppo 3′ OH interromperà la reazione di condensazione tra il fosfato 5′ (in seguito alla scissione del pirofosfato) del nucleotide in arrivo con il gruppo idrossile 3′ del nucleotide precedente sul filamento in crescita. Questa reazione di condensazione avviene normalmente con l’incorporazione di un dNTP non modificato da parte della DNA polimerasi. In termini più semplici, l’attacco nucleofilo del gruppo 3′ OH porta all’aggiunta di un nucleotide su una catena in crescita. L’assenza del gruppo idrossile 3′ inibisce questo attacco nucleofilo, disabilitando la capacità della DNA polimerasi di continuare la sua funzione.
Questa scoperta ha portato al suo nome appropriato “Nucleotidi che terminano la catena”. I dideossiribonucleotidi non hanno un gruppo idrossile al 3′, quindi non può avvenire nessun ulteriore allungamento della catena una volta che questo dideossinucleotide è sulla catena. Questo può portare alla terminazione della sequenza del DNA. Così, queste molecole formano la base del metodo di terminazione a catena dideossi del sequenziamento del DNA, che è stato riportato da Frederick Sanger e il suo team nel 1977 come estensione del lavoro precedente. L’approccio di Sanger è stato descritto nel 2001 come uno dei due metodi fondamentali per il sequenziamento dei frammenti di DNA (l’altro è il metodo Maxam-Gilbert), ma il metodo Sanger è sia il “più usato che il metodo usato dalla maggior parte dei sequenziatori automatici di DNA”. Sanger ha vinto il suo secondo premio Nobel per la chimica nel 1980, condividendolo con Walter Gilbert (“per i loro contributi riguardanti la determinazione delle sequenze di basi negli acidi nucleici”) e con Paul Berg (“per i suoi studi fondamentali sulla biochimica degli acidi nucleici, con particolare riguardo al DNA ricombinante”), e ha discusso l’uso dei dideossinucleotidi nella sua conferenza Nobel.
Sequenziamento del DNAModifica
I dideossinucleotidi sono utili nel sequenziamento del DNA in combinazione con l’elettroforesi. Un campione di DNA sottoposto a PCR (reazione a catena della polimerasi) in una miscela contenente tutti e quattro i deossinucleotidi e un dideossinucleotide produrrà filamenti di lunghezza uguale alla posizione di ogni base del tipo che completa il tipo che ha un dideossinucleotide presente. La taq polimerasi usata nella PCR favorisce il ddGNTP, che è stato un modello osservato in varie ricerche. Cioè, ogni base nucleotidica di quel tipo particolare ha una probabilità di essere legata non a un deossinucleotide ma piuttosto a un dideossinucleotide, che termina l’allungamento della catena. Quindi, se il campione viene sottoposto a elettroforesi, ci sarà una banda presente per ogni lunghezza in cui è presente il complemento del dideossinucleotide. Ora è comune usare dideossinucleotidi fluorescenti in modo che ognuno dei quattro abbia una fluorescenza diversa che può essere rilevata da un sequenziatore; quindi è necessaria solo una reazione.