Abstract
Gli studi sugli effetti dei polisaccaridi arabinoxilani (AX) sulla risposta postprandiale al glucosio hanno portato a risultati contrastanti a causa della diversità delle strutture AX. Quattro estratti AX estraibili in acqua (WEAX) ottenuti dall’aleurone e dalla crusca di grano sono stati utilizzati per studiare (a) l’effetto di AX sulle attività di α-amilasi e α-glucosidasi, (b) l’influenza della composizione chimica di AX sulla loro potenza di inibizione e (c) la cinetica dell’inibizione enzimatica. L’attività dell’α-amilasi non è stata significativamente influenzata dalla presenza di frazioni di WEAX, indipendentemente dal tipo o dalla concentrazione. WEAX ha inibito l’attività dell’α-glucosidasi solo quando il maltosio è stato usato come substrato ma non il saccarosio. I valori IC50 di WEAX (- mg/mL) erano altamente correlati al contenuto di acido ferulico (), al rapporto arabinosio/xilosio () e alle proporzioni relative di xilosio non sostituito (), disostituito () e monosostituito (). Il grafico Lineweaver-Burk ha suggerito una modalità di inibizione enzimatica non competitiva. Pertanto, i nostri risultati suggeriscono che le proprietà antiglicemiche di WEAX possono derivare dall’inibizione diretta dell’attività dell’α-glucosidasi.
1. Introduzione
La prevalenza del diabete di tipo 2 è in aumento a livello globale. Il diabete è una malattia cronica caratterizzata da un elevato glucosio plasmatico circolante. Quindi la gestione del glucosio postprandiale è fondamentale nella prevenzione e nel trattamento dei pazienti con diabete di tipo 2. Studi di intervento sull’uomo hanno dimostrato che il consumo di una dieta ricca di arabinoxilani (AX) attenua i livelli di glucosio nel sangue postprandiale in soggetti sani, con alterata tolleranza al glucosio e diabetici. Al contrario, Mohlig e colleghi non hanno trovato alcun effetto sulla risposta al glucosio quando soggetti umani sani sono stati alimentati con panini integrati con AX. Gli studi sugli animali hanno anche riportato risultati contrastanti sull’effetto della supplementazione di AX. I meccanismi sottostanti rimangono poco chiari, ma si presume che le fibre solubili aumentano la viscosità del lume, ritardando così l’assorbimento dei nutrienti. La viscosità apparente delle soluzioni AX è influenzata dalla conformazione asimmetrica e dal peso molecolare degli AX, nonché dalla concentrazione del polimero. Di questi tre fattori, la concentrazione di AX sembra influenzare maggiormente la viscosità. Quindi l’effetto degli AX sul glucosio nel sangue è dose-dipendente. La viscosità apparente delle soluzioni AX dipende anche dalla sollecitazione di taglio, in modo tale che una maggiore sollecitazione di taglio provoca un assottigliamento di taglio, il comportamento caratteristico dei fluidi non newtoniani. Studi recenti suggeriscono che l’effetto della viscosità dell’AX può essere compensato da una forte peristalsi intestinale.
La struttura molecolare dell’AX è complessa ed eterogenea. Gli AX consistono in una spina dorsale di xilano composta da residui di β-D-xilopiranosile (Xylp) collegati con residui di α-L-arabinofuranosile (Araf) collegati alla spina dorsale di xilano nelle posizioni C(O)-2 e C(O)-3 e/o in entrambe le posizioni C(O)-2 e C(O)-3 . I residui di xilosio possono anche essere sostituiti con legami di acido glucuronico e/o acido metilglucuronico. I residui di acido ferulico o cumarico sono legati con estere ai residui di arabinosio in posizione C(O)-5 . Il rapporto tra arabinosio e xilosio, il modello di sostituzione dell’arabinosio, il grado di feruloilazione e il peso molecolare variano notevolmente tra e all’interno dei cereali. Gli arabinoxilani (AX) costituiscono la più alta proporzione di fibra alimentare nei chicchi di cereali (60-70%) e il loro contenuto varia con la fonte o la frazione del chicco. L’AX rappresenta l’1,3-2,7% p/p del grano. L’aleurone e il pericarpo del grano contengono rispettivamente il 20 e il 45% di AX. Gran parte degli AX nel grano sono insolubili in acqua (70-86%).
I carboidrati digeribili sono idrolizzati in zuccheri monomerici, glucosio o fruttosio prima del loro assorbimento nel tratto gastrointestinale. L’amido viene digerito principalmente in maltosio e altri carboidrati a catena corta dall’amilasi salivare e pancreatica. Il risultato (maltosio, maltotriosio e destrine α-limite) e il saccarosio sono digeriti a glucosio o fruttosio dalle α-glucosidasi del piccolo bordo a spazzola intestinale (maltasi-glucoamilasi e sucrasi-isomaltasi). L’assorbimento dello zucchero nell’intestino tenue coinvolge principalmente i trasportatori GLUT2, GLUT5 e SGLT1. Così la diminuzione dell’iperglicemia postprandiale può essere ottenuta limitando la digestione o l’assorbimento intestinale dei carboidrati. Nonostante le enormi differenze nella struttura degli AX, la maggior parte degli studi riporta pochi o nessun dettaglio della composizione o della struttura degli AX utilizzati, rendendo difficile confrontare i risultati sull’effetto degli AX sulla glicemia postprandiale. Esistono anche dati molto limitati sull’effetto degli AX purificati estraibili in acqua sugli enzimi digestivi dei carboidrati. Così in questo studio abbiamo mirato a indagare (a) l’effetto di AX sulle attività di α-amilasi e α-glucosidasi, (b) l’influenza della composizione chimica di AX sulla loro potenza di inibizione, e (c) la cinetica di inibizione enzimatica.
2. Materiali e metodi
2.1. Prodotti chimici e reagenti
Un aleurone di grano commerciale (aleurone di grano Grainwise) è stato un regalo di Cargill Limited e Horizon Milling (Wichita, Kansas, USA). Consiste di 4,5, 15,2, 7,4 e 2,5% di lipidi, proteine, ceneri e amido, rispettivamente. La crusca di grano duro invernale è stata acquistata localmente da Bulk Barn (Winnipeg, Manitoba, Canada). Il suo contenuto di umidità, ceneri e proteine è stato analizzato rispettivamente al 5,8, 5,3 e 11,1%. L’amido di frumento non modificato, il maltosio, il saccarosio, l’acarbosio, l’α-amilasi del pancreas suino (EC 3.2.1.1, tipo VI-B), l’amiloglucosidasi (EC 3.2.1.3) dell’aspergillus e le polveri di acetone intestinale di ratto sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Il solfato di ammonio, tutti gli acidi e i solventi organici sono stati acquistati da Fischer Scientific (Whitby, Ontario, Canada). Il kit per il dosaggio di maltosio, saccarosio e glucosio (K-MASUG 08/13) è stato acquistato da Megazyme International Ireland (Bray, Wicklow, Irlanda). Tutti i prodotti chimici utilizzati erano di grado analitico o HPLC.
2.2. Preparazione dell’arabinoxilano estraibile in acqua
Gli enzimi endogeni sono stati inattivati facendo bollire campioni di crusca e aleurone di grano (~200 g) in 2 L di etanolo acquoso (80%, v/v) a 85°C sotto riflusso per 2 ore. Il surnatante è stato scartato e il residuo è stato essiccato all’aria in una stufa per una notte a temperatura ambiente. Le frazioni estraibili in acqua sono state isolate dalla crusca o dall’aleurone essiccati all’aria (150 g) a 45°C secondo il metodo descritto da Izydorczyk e Biliaderis. L’estratto acquoso è stato destarizzato con α-amilasi (1821 U/L) e deproteinizzato con celite e terra di pienezza. Il materiale purificato è stato frazionato mediante precipitazione graduale di solfato di ammonio (AS) e sono state ottenute frazioni al 50 e al 75% di saturazione AS. Il materiale raccolto è stato liofilizzato dopo essere stato dializzato (membrana di cut-off 12 kDa) per 48 ore. Le frazioni estraibili in acqua raccolte dall’aleurone di grano sono state etichettate (WA) seguite dalla concentrazione di AS alla quale sono state ottenute (WA-f50 e WA-f75). Allo stesso modo, i materiali raccolti dalla crusca di grano (WB) sono stati designati come WB-f50 e WB-f75. Le descrizioni chimiche e strutturali delle frazioni WEAX sono presentate nella tabella 1.
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| Valori presentati come media ± deviazione standard (). Un-Xylp: residui di xilosio non sostituiti, mono-Xylp: residui di xilosio monosostituiti, di-Xylp: O-2 e O-3 residui di xilosio disostituiti.WA-f50 e WA-f75: frazioni estraibili in acqua da WA ottenute al 50 e 75% di saturazione di solfato di ammonio, rispettivamente. WB-f50 e WB-f75: frazioni estraibili in acqua da WB ottenute rispettivamente al 50 e al 75% di saturazione di solfato di ammonio. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
L’amido di frumento (300 mg) è stato sospeso in 15 mL di tampone di fosfato di sodio (pH 6.9, 0.1 M) contenente 1 mM di cloruro di calcio e cotto a 95°C per 15 minuti. Le frazioni WEAX (40 mg) sono state dissolte in 2 mL di tampone di fosfato di sodio. I campioni sono stati diluiti in modo che la concentrazione finale nella miscela di reazione era 0,0, 0,2, 0,3, e 0,5% (w / v). Volumi uguali (200 μL) di amido e WEAX (o controllo) sono stati mescolati e agitati. L’idrolisi dell’amido è stata avviata aggiungendo 70 μL di α-amilasi pancreatica suina (130 U/mL) e 40 μL di amiloglucosidasi fungina (240 U/mL). La reazione è stata fermata dopo 30 minuti riscaldando a 95°C per 5 minuti. La miscela è stata immediatamente raffreddata su ghiaccio e centrifugata (Thermo Scientific, Sorvall Legend Micro21, Germania). I surnatanti sono stati raccolti e analizzati per il glucosio utilizzando il kit per il test del glucosio Megazyme. Gli studi di intervento sull’uomo hanno riportato l’efficacia di una concentrazione da 0,25 a 0,70% di AX e quindi la nostra scelta dell’intervallo di concentrazione.
2.4. Saggio di inibizione dell’attività dell’α-glucosidasi intestinale di ratto
Il metodo di inibizione dell’α-glucosidasi di Oki et al. è stato utilizzato con modifiche. Brevemente, la polvere di acetone intestinale di ratto (500 mg) è stata mescolata con 10 mL di tampone di fosfato di sodio (pH 6.9, 0.1 M) e sonicata in bagno di ghiaccio per 30 secondi (12 volte) con 15 secondi di pausa per evitare l’accumulo di calore. La miscela è stata poi centrifugata a 10000 a 4°C per 10 minuti. Il surnatante è stato raccolto ed etichettato come α-glucosidasi intestinale di ratto. I campioni di WEAX (40 mg) sono stati sciolti in 2 mL di tampone fosfato di sodio (pH 6.9, 0.1 M). Successivamente, 50 μL di α-glucosidasi intestinale di ratto sono stati mescolati con 100 μL di campione o tampone (controllo) e incubati a 37°C per 5 minuti. Cinquanta μL di saccarosio 20 mM o maltosio 4 mM sono stati aggiunti e ulteriormente incubati per 60 minuti (saccarosio) o 30 minuti (maltosio). La concentrazione finale della frazione WEAX era 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, e 0.0% (w/v). L’attività dell’enzima è stata arrestata riscaldando a 95°C per 10 minuti. Dopo la centrifugazione a 10000 per 10 minuti, i surnatanti sono stati raccolti per l’analisi del glucosio usando il kit Megazyme GOPOD glucose test. L’inibizione % dell’alfa glucosidasi (sucrasi o maltasi) è stata calcolata come . Il valore IC50 è stato determinato dal grafico della % di inibizione dell’α-glucosidasi contro la concentrazione del campione. L’inibizione dell’α-glucosidasi intestinale del ratto con l’acarbose (un noto inibitore dell’α-glucosidasi) è stata fatta anche a scopo di confronto. Le concentrazioni di acarbosio di 1.625, 3.25, 4.9, 6.5, 9.8, e 13 μg/mL sono state usate al posto del campione.
2.5. Analisi statistica
Tutte le analisi sono state eseguite in sestuplicato (salvo diversa indicazione) e tutte le statistiche sono state calcolate utilizzando l’analisi della varianza (ANOVA) a una via su un software statistico JMP 12 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Le medie dei campioni sono state confrontate con il metodo Tukey HSD e le differenze significative sono state determinate a . Le correlazioni tra i parametri sono state calcolate usando il test di correlazione di Pearson.
3. Risultati e discussione
Gli effetti di WEAX sull’idrolisi dell’amido sono presentati nella Figura 1. Abbiamo confrontato la quantità di glucosio rilasciato in 30 minuti di incubazione con α-amilasi in presenza o assenza di frazioni WEAX. L’aggiunta di frazioni WEAX ha diminuito numericamente la quantità di glucosio prodotta rispetto al trattamento di controllo. Tuttavia, i confronti statistici tra i gruppi di trattamento e il controllo hanno mostrato che la differenza media non era significativa () per WA-f50, WA-f75 e WB-f75 indipendentemente dalla concentrazione di WEAX. La presenza di 0,5% WB-f50 ha portato a una diminuzione significativa dell’amilolisi rispetto al controllo (). Tuttavia, le nostre osservazioni per l’attività dell’alfa amilasi contrastano con altri rapporti in letteratura, probabilmente a causa della concentrazione e del tipo di AX. L’amilolisi dell’amido è stata eseguita in presenza di 1 e 2% AX e l’AX usato era privo di acido ferulico. Abbiamo usato concentrazioni di AX (~5-10 g) equivalenti a quelle riportate per attenuare la glicemia postprandiale negli studi sull’uomo.
La tabella 2 mostra l’effetto di WEAX sull’attività dell’α-glucosidasi in presenza di saccarosio o maltosio come substrato. I dati sono presentati come IC50 che è la concentrazione dell’inibitore che provoca il 50% di inibizione dell’attività dell’α-glucosidasi. I valori IC50 variavano da 4,88 a 10,14 mg/mL contro l’attività dell’α-glucosidasi con maltosio come substrato. Tuttavia, nessuna inibizione è stata osservata quando il saccarosio è stato usato come substrato. La potenza inibitoria di WEAX contro la maltasi intestinale era 1000-2000 volte inferiore rispetto all’acarbose (un controllo positivo). È ampiamente ipotizzato che la viscosità possa essere la causa dell’effetto dell’AX sul glucosio postprandiale. Così Vogel et al. hanno alimentato i ratti con una crusca di grano modificata AX per studiare l’effetto della viscosità. Inoltre, l’inibizione dell’alfa glucosidasi intestinale da parte dei mono-/oligosaccaridi AX era anche legata alla loro frazione di acido ferulico. Quindi, WA-f50 e WB-f75 avevano una potenza di inibizione significativamente diversa nei confronti dell’attività dell’α-glucosidasi pur avendo proporzioni relative simili di residui di xilosio non sostituiti (un-Xylp), monosostituiti (2-Xylp o 3-Xylp) e disostituiti (2,3-Xylp) e grado di sostituzione, ma diverso contenuto di acido ferulico.
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| I dati rappresentano i valori del coefficiente di correlazione Pearson a . un-Xylp: residui di xilosio non sostituiti, mono-Xylp: residui di xilosio monosostituiti, di-Xylp: C (O)-2 e C (O)-3 residui di xilosio disostituiti. | ||||||||||||||||||||||||||
Il rapporto tra arabinosio e xilosio è una misura del grado di sostituzione (DS). Una forte associazione lineare negativa ( = -0,67) è stata osservata tra DS e IC50. Questo potrebbe essere una conseguenza dell’aumentata solubilità dell’AX dovuta all’alta DS. Così WEAX altamente sostituito sembra avere un valore IC50 più basso (alta potenza di inibizione). La stessa osservazione è stata supportata dall’associazione negativa tra la potenza di inibizione e la proporzione relativa di residui di xilosio non sostituiti. Il rapporto apparente tra residui di-Xyl e mono-Xyl non sembra avere influenza, ma il grado di sostituzione dello xilosio ha mostrato un effetto. Quindi è probabile che l’effetto sull’attività dell’α-glucosidasi possa provenire dai residui di arabinosio di WEAX. Ci sono stati rapporti sull’arabinosio che inibisce l’attività dell’α-glucosidasi. I tentativi di rimuovere i residui di arabinosio da WEAX usando l’arabinofuranosidasi non hanno avuto successo per provare l’ipotesi. Tuttavia, abbiamo notato che il mono-Xyl a C (O)-2 era un fattore determinante rispetto al mono-Xyl a C (O)-3, suggerendo che la potenza di inibizione andava oltre la semplice presenza di residui di arabinosio. C’era una forte correlazione tra il mono-Xyl a C (O)-2 e il contenuto di acido ferulico ( = 0,99). Quindi è possibile che l’influenza osservata di DS potrebbe essere derivata da quella dell’acido ferulico.
Il grafico Lineweaver-Burk (Figura 2) è stato utilizzato per calcolare la velocità massima apparente () e la costante di Michaelis-Menten () per l’attività α-glucosidasi su maltosio in presenza e assenza di WEAX. L’effetto della frazione WEAX su e è stato analizzato per determinare il tipo di inibizione. e di α-glucosidasi per il maltosio in assenza di frazioni WEAX erano 17,5 μg di glucosio al minuto e 5,99 mM, rispettivamente. La tabella 4 mostra che l’aggiunta di frazioni WEAX ha diminuito entrambi i valori, suggerendo che WEAX ha inibito l’attività dell’α-glucosidasi attraverso una modalità non competitiva. Una caratteristica tipica dell’inibizione non competitiva è che entrambi e diminuiscono in presenza dell’inibitore. Quindi è plausibile che le frazioni di WEAX si leghino al complesso del substrato dell’enzima diminuendo così sia e . L’arabinosio è stato anche trovato per inibire l’attività dell’α-glucosidasi attraverso una modalità non competitiva.
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| Valori presentati come media ± deviazione standard (). I dati nella stessa colonna con lo stesso apice non sono significativamente diversi a . = velocità massima; è la costante di Michalelis-Menten (concentrazione di substrato richiesta per un enzima per raggiungere la metà). nd significa non determinato. WA-f50 e WA-f75: frazioni estraibili in acqua da WA ottenute rispettivamente al 50 e al 75% di saturazione di solfato di ammonio. WB-f50 e WB-f75: frazioni estraibili in acqua da WB ottenute al 50 e 75% di saturazione di solfato di ammonio, rispettivamente. | |||||||||||||||||||||||||||
I nostri risultati possono fornire una spiegazione sull’incoerenza osservata in letteratura circa l’effetto di AX sul livello di glucosio postprandiale. L’alimentazione di ratti diabetici Zuker con pane integrato con AX (Ara/Xyl = 0,9) ha portato ad una significativa diminuzione del livello di glucosio nel sangue postprandiale. Al contrario, l’assunzione di AX nativo (Ara/Xyl = 0.5) non ha avuto alcun effetto sulla risposta della glicemia. Inoltre, l’integrazione di diete con 6 e 12 g di AX (Ara/Xyl = 0,66 o 0,8) ha diminuito la glicemia sia in soggetti sani che diabetici. Tuttavia, AX (Ara/Xyl = 0,8) non ha attenuato la risposta postprandiale del glucosio in adulti sani. I maiali nutriti con pane bianco integrato con AX avevano un ridotto flusso netto di glucosio rispetto ai maiali nutriti con pane bianco. L’assenza di composizione chimica dettagliata e strutture rende difficile confrontare i risultati sull’efficacia degli AX. Così, anche se le concentrazioni di AX utilizzate possono essere le stesse, la sua efficacia dipenderebbe dalla natura degli AX utilizzati. Abbiamo dimostrato che gli AX ottenuti al 50% di saturazione di solfato di ammonio hanno esibito una maggiore potenza di inibizione rispetto agli AX ottenuti al 75%.
4. Conclusione
I risultati di questo studio hanno indicato che l’effetto antiglicemico degli arabinoxilani può derivare dall’inibizione dell’attività dell’α-glucosidasi intestinale ma non dell’attività dell’amilasi. La potenza dell’AX estraibile in acqua sull’attività dell’α-glucosidasi è stata influenzata dal contenuto di acido ferulico, dal rapporto tra arabinosio e xilosio e dal modello di sostituzione dello xilosio. I risultati suggeriscono anche che l’inibizione dell’attività dell’α-glucosidasi avviene attraverso un meccanismo non competitivo. Pertanto, il consumo di una dieta ricca di AX estraibile in acqua può attenuare il livello di glucosio nel sangue postprandiale.
Divulgazione
Parte dei risultati è stata presentata come poster orale al simposio Functional Foods and Natural Health Products Graduate Research (FFNHP)/Therapeutic Applications of Functional Foods and Bioactives (TAFFB) tenutosi presso il St-Boniface Hospital Albrechtsen Research Centre dal 20 al 22 aprile 2016.
Conflitti di interesse
Tutti i fondi o il supporto materiale ricevuti non hanno portato a conflitti di interesse nella pubblicazione di questo manoscritto.
Riconoscimenti
Questa ricerca è stata finanziata dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) attraverso il Discovery Grant Programme. Gli autori sono anche grati a Cargill Limited per la fornitura di campioni di aleurone di grano e a Ce Zhou, Alison Ser, e Pat Kenyon del Dipartimento di Scienza dell’Alimentazione, Università di Manitoba, per il loro supporto tecnico.