Enzimi antiossidanti, indici infiammatori e fattori di stile di vita negli uomini anziani: un’analisi di coorte

Abstract

Abbiamo esaminato il rapporto tra attività degli enzimi antiossidanti nel sangue, indici di stato infiammatorio e una serie di fattori di stile di vita nello studio di coorte Caerphilly prospettiva di malattia cardiaca ischemica. Lo studio è iniziato nel 1979 e si basa su un campione rappresentativo della popolazione maschile. Inizialmente 2512 uomini sono stati visti nella fase I, e seguiti ogni 5 anni nelle fasi II e III; recentemente sono stati visti nella fase IV. I dati sulla classe sociale, l’abitudine al fumo, il consumo di alcol sono stati ottenuti tramite questionario, e l’indice di massa corporea è stato misurato. Le attività degli enzimi antiossidanti e gli indici dello stato infiammatorio sono stati stimati con tecniche standard. Associazioni significative sono state osservate per: età con α-1-antichimotripsina (p<0.0001) e con caeruloplasmina, sia proteina che ossidasi (p<0.0001); abitudine al fumo con α-1-antichimotripsina (p<0.0001), con caeruloplasmina, sia proteina che ossidasi (p<0.0001) e con glutatione perossidoso (GPX) (p<0.0001); classe sociale con α-1-antichimotripsina (p<0,0001), con caeruloplasmina sia proteina (p<0,001) che ossidasi (p<0,01) e con GPX (p<0,0001); indice di massa corporea con α-1-antichimotripsina (p<0,0001) e con proteina caeruloplasmina (p<0,001). Non c’era alcuna associazione significativa tra il consumo di alcol e nessuno degli enzimi ematici misurati. L’analisi dei fattori ha prodotto un modello a tre fattori (che spiega il 65,9% della variazione nel set di dati) che sembra indicare una stretta interrelazione tra gli antiossidanti.

Introduzione

La malattia cardiaca ischemica continua ad essere una delle principali cause di morte in Europa e negli Stati Uniti.1 Negli ultimi anni c’è stato molto interesse per il ruolo patologico dei radicali liberi nello sviluppo dell’aterosclerosi.2-5 Il corpo ha sviluppato una complessa strategia di difesa per ridurre al minimo gli effetti dannosi di vari ossidanti. Al centro di questa difesa ci sono gli enzimi antiossidanti del sangue. Essi comprendono la superossido dismutasi (SOD, EC 1.15.1.1), la glutatione perossidasi (GPX, EC 1.11.1.9), la catalasi (EC 1.11.1.6) e la caeruloplasmina, che agiscono di concerto per proteggere l’organismo dai danni ossidativi.6 La superossido dismutasi eritrocitaria è rame-dipendente (anche se lo zinco ha un ruolo strutturale) e accelera la dismutazione del superossido O2- in H2O2 e O2.7 L’enzima glutatione perossidasi, contenente selenio, disintossica l’H2O2 utilizzando il glutatione ridotto (GSH) e l’H2O2 come substrati per produrre H2O e glutatione ossidato (GSSG);8 il GSSG, a sua volta, viene ridotto a GSH dall’enzima glutatione reduttasi che richiede NADPH come riduttore; quest’ultimo viene fornito dall’enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G-6-PDH, EC 1.1.1.49). La catalasi è un grande enzima che contiene ferro legato all’ematite nei suoi siti attivi. Rimuove l’H2O2 scindendolo direttamente in O2.9 Nel plasma, la caeruloplasmina (ossidasi) agisce come un importante antiossidante nella protezione dell’organismo dallo stress ossidativo. Quest’ultimo enzima, insieme all’alfa-1-antichimotripsina, è anche un reattivo di fase acuta e può essere usato per indicare lo stato infiammatorio.

Le prove accumulate suggeriscono che alterazioni o disturbi in questi sistemi enzimatici difensivi possono contribuire a, o esacerbare, lo sviluppo dell’aterosclerosi.10-12 Altri studi che esaminano l’effetto dell’invecchiamento sulle attività degli enzimi antiossidanti del miocardio e sulla perossidazione lipidica nei ratti hanno dimostrato che la capacità antiossidante del miocardio si indebolisce durante l’invecchiamento, aumentando la possibilità di danni ossidativi.13 Negli esseri umani, è stato dimostrato che il fumo, uno dei principali fattori di rischio per l’aterosclerosi, deprime l’attività della glutatione perossidasi plasmatica.14 Gli autori dello studio sostengono che la scoperta è coerente con l’idea che i fumatori sono sottoposti a un carico ossidativo sostenuto, e che uno stato antiossidante inadeguato combinato con l’aumentato carico di radicali liberi causato dal fumo, può esacerbare l’ossidazione delle LDL e aumentarne le proprietà aterogene. Questo può essere particolarmente vero in una popolazione ad alto rischio di malattia coronarica. Una diminuzione delle attività di glutatione perossidasi, superossido dismutasi e catalasi è stata osservata anche nelle piastrine di individui con malattia coronarica,15 e in individui con infarto miocardico acuto.16-17

La maggior parte degli studi che esaminano le attività degli enzimi antiossidanti e le malattie cardiache sono stati condotti su soggetti altamente selezionati, utilizzando campioni relativamente piccoli. Lo studio prospettico di coorte Caerphilly sulle malattie cardiache ischemiche, l’ictus e il declino cognitivo ha dato l’opportunità di studiare le attività degli enzimi antiossidanti nel sangue in un campione rappresentativo della popolazione maschile e di esplorare le possibili interrelazioni tra attività degli enzimi antiossidanti, età, classe sociale, abitudine al fumo e consumo di alcol.

Metodi

Una descrizione completa della coorte Caerphilly e la raccolta di dati relativi a malattie cardiache, ictus e altre condizioni è stata data altrove;18-21 solo una breve descrizione è presentata qui. Inizialmente 2512 uomini sono stati visti nella fase I (1979-1983), quando avevano 45-59 anni. Gli uomini sono stati successivamente seguiti dopo ogni periodo di 5 anni (nelle fasi II e III) e sono stati visti recentemente nella fase IV. Quando gli uomini avevano 55-69 anni (fase III), sono stati prelevati campioni di sangue a digiuno per la stima delle vitamine e degli enzimi antiossidanti nel sangue. Sfortunatamente, gli esami degli uomini erano iniziati alcuni mesi prima che si presentasse l’opportunità di queste stime e il sangue non fu ottenuto da alcune centinaia di uomini per le stime antiossidanti. Il plasma è stato separato dagli eritrociti mediante centrifugazione a bassa velocità e gli eritrociti sono stati lavati con soluzione fisiologica. Sia il plasma che gli eritrociti lavati sono stati conservati a -70 °C prima dell’analisi.

Gli enzimi antiossidanti sono stati stimati con metodi standard come segue. Le attività di superossido dismutasi, glutatione perossidasi e glucosio-6-fosfato deidrogenasi sono state stimate su un analizzatore automatico Cobas Fara utilizzando kit disponibili in commercio forniti da Randox Laboratories. L’attività della catalasi eritrocitaria è stata stimata con il metodo di Aebi22 utilizzando uno spettrometro Varian Cary 1. L’emoglobina eritrocitaria (Hb) è stata misurata con una modifica del metodo descritto da Dacie e Lewis23 utilizzando un emoglobinometro dedicato (Coulter Electronics). Il test è stato calibrato utilizzando la cianmetaemoglobina (HiCN) standard, conforme a B.S. 3985 (BDH) come raccomandato dal produttore. Le proteine della fase acuta alfa-1-antichimotripsina e caeruloplasmina sono state stimate utilizzando metodi immunoturbidometrici e kit commerciali forniti da Dako, con l’eccezione che le aliquote utilizzate per queste analisi sono state diluite manualmente anziché automaticamente prima del dosaggio su un analizzatore automatico Cobas Fara. L’attività della caeruloplasmina ossidasi (CpO) è stata stimata sul Cobas Fara utilizzando la p-fenilendiammina dicloridrato come substrato.24 Le variazioni intra e interbatch erano <6,5% per tutti gli analiti misurati.

I dati aggiuntivi, tra cui l’abitudine al fumo, la classe sociale, il consumo di alcol e l’indice di massa corporea sono stati raccolti tramite questionario e misurazione fisica, rispettivamente; i dettagli completi sono stati descritti in precedenza.19

Analisi statistica

Le distribuzioni dei vari parametri misurati sono state esaminate per la normalità usando il test di Kolmogorov Smirnov. I risultati sono presentati come medie, mediane e deviazioni standard (SD), insieme alla media e agli intervalli del 95% ottenuti dopo la trasformazione dei dati, se necessario. Le interrelazioni tra le varie serie di dati sono state esaminate tramite correlazione, regressione in una matrice di correlazione, e tramite analisi dei fattori, e per queste, le variabili sono state trasformate, di solito in logaritmi, per raggiungere la normalità o quasi normalità, dove appropriato. Le analisi dei fattori sono state eseguite nel tentativo di estrarre un numero relativamente piccolo di fattori o costrutti sottostanti che avrebbero semplificato le interrelazioni delle variabili e quindi facilitato la comprensione dei processi complessi.

Risultati

C’erano 2154 uomini nella coorte al momento degli esami di fase III (1989-1993). Campioni di sangue a digiuno sono stati ottenuti da 1800 di questi, che rappresentano l’84% della coorte totale.

Mediane, mediane e SD per gli enzimi antiossidanti studiati nella coorte di uomini Caerphilly sono mostrati nella tabella 1. Solo SOD e GPX sono stati trovati normalmente distribuiti. I risultati sono presentati per tutti gli enzimi come dati grezzi e anche dopo la trasformazione logaritmica. Le interrelazioni (mostrate come coefficienti di correlazione), tra i vari enzimi antiossidanti nella coorte sono mostrate nella Tabella 2. Correlazioni significative sono state osservate tra un certo numero di misure, in particolare quelle che sono collegate attraverso lo stato infiammatorio, cioè l’alfa-1-antichimotripsina e la caeruloplasmina (proteina e ossidasi). Le associazioni dei livelli di enzimi nel sangue sono state anche confrontate con un certo numero di variabili, in particolare: età, abitudine al fumo, classe sociale, indice di massa corporea e consumo di alcol. I risultati sono mostrati nella tabella 3. I dati sono stati entrambi esaminati come dati grezzi e standardizzati per consentire i possibili effetti dei confondenti. Non ci sono state grandi differenze tra i due. Pertanto vengono presentati solo i dati standardizzati. Associazioni significative sono state osservate per: età con alfa-1-antichimotripsina e con caeruloplasmina, sia proteina che ossidasi; abitudine al fumo con alfa-1-antichimotripsina, con caeruloplasmina (proteina e ossidasi) e con GPX; classe sociale con alfa-1-antichimotripsina, con caeruloplasmina (proteina e ossidasi) e con GPX; indice di massa corporea con alfa-1-antichimotripsina e con proteina caeruloplasmina. Nessuna associazione significativa è stata osservata tra il consumo di alcol e uno qualsiasi degli enzimi del sangue misurati.

Quando l’analisi dei fattori è stata applicata alle sette variabili del plasma (n=1689), sono stati derivati due fattori comuni con valori eigen di 2,24 e 1,40, che insieme hanno spiegato il 52,1% della variazione totale nel set di dati. Il fattore 1 ha spiegato il 32,0% della variazione totale dell’insieme di dati. Era più strettamente associato all’alfa-1-antichimotripsina, alla proteina caeruloplasmina e all’ossidasi (e in misura meno importante alla SOD e alla catalasi). Il fattore 2 ha spiegato un ulteriore 20,1% della variazione totale. Era più strettamente associato a SOD, catalasi, G-6-PDH e GPX.

Le misure di adeguatezza del modello erano adeguate, con la notevole eccezione di basse comunalità di tre delle variabili (0,42 per SOD, 0,34 per G-6-PDH, 0,18 per GPX) che ha reso il modello inaccettabile.

Un modello a tre fattori è stato anche costruito. Anche se il terzo fattore spiega marginalmente meno della variazione totale nel set di dati rispetto a una singola variabile, le comunalità delle variabili (e altre misure dell’adeguatezza del modello) migliorano, indicando che questo modello fornisce una descrizione più adeguata delle interrelazioni tra le variabili osservate. Il fattore 3 spiega un ulteriore 13,8% della variazione totale nel set di dati, dando un totale per il modello a tre fattori del 65,9%. Il fattore 1 è ancora più strettamente associato all’alfa-1-antichimotripsina, alla proteina caeruloplasmina e all’ossidasi. Il fattore 2 è più strettamente associato a SOD e catalasi (e in misura molto minore a G-6-PDH). Il fattore 3 è più strettamente associato con GPX e G-6-PDH.

Il miglioramento più evidente nell’adeguatezza del modello a tre fattori rispetto al modello a due fattori è il miglioramento della comunalità di GPX (da 0,18 a 0,78). Anche le comunalità di SOD e G-6-PDH sono migliorate (a 0,63 e 0,42). Sembrerebbe che la GPX abbia un ruolo particolare che non è contenuto nel modello a tre fattori.

Discussione

La coorte di uomini di Caerphilly è stata ampiamente studiata dall’inizio del progetto nel 1979.25-29 Uno dei punti di forza dei dati attuali è che sono stati derivati da un campione rappresentativo della popolazione. Caerphilly, nel sud del Galles, è una tipica area industriale/residenziale, anche se la distribuzione della classe sociale suggerisce che ci può essere una certa distorsione verso le occupazioni manuali. Lo scopo del presente studio era quello di ottenere statistiche descrittive ed esaminare le possibili interrelazioni tra le attività degli enzimi antiossidanti nel sangue, utilizzando l’analisi dei fattori come tecnica di riduzione dei dati e creazione di ipotesi. Inoltre, sono state studiate le possibili relazioni tra gli enzimi antiossidanti e una serie di varianti dello stile di vita. Anche se attualmente non ci sono intervalli di riferimento definitivi per gli enzimi antiossidanti SOD, GPX e catalasi, i risultati sono stati inizialmente confrontati con i dati precedentemente pubblicati prima di esplorare le possibili relazioni tra gli enzimi antiossidanti e i fattori dello stile di vita.

L’attività SOD è quantificata indirettamente in un campione dalla capacità di quel campione di ridurre il flusso di radicali liberi rilevato. Le attività della SOD variano tra i sistemi di dosaggio e quindi i produttori di kit non raccomandano intervalli di riferimento. Tuttavia, i dati ottenuti sul campione di Caerphilly sono comparabili con i risultati precedentemente pubblicati utilizzando lo stesso kit analitico.30 Le attività di GPX possono anche variare all’interno e tra i sistemi di analisi. Si pensa che la GPX ossidata sia suscettibile di disattivazione da parte del cianuro, che è contenuto nel reagente Drabkins utilizzato per stabilizzare l’emoglobina nei campioni e impedire il verificarsi di altre reazioni enzimatiche.31 Questo problema è stato superato con l’aggiunta di ditiotreitolo/ditionite nel tampone di diluizione. I risultati della coorte di Caerphilly (38,0±11,0SD IU/g Hb) sono simili a quelli di uno studio pubblicato di recente (36,1±6,5 IU/g Hb).32 Quest’ultimo studio, tuttavia, era basato su un numero molto piccolo (n=10) di pazienti con infarto del miocardio. Le attività medie della catalasi nella coorte di Caerphilly erano paragonabili a uno studio precedente, anche se molto più piccolo30 del nostro laboratorio su un gruppo di maschi di 50-54 anni (52,9±17,1 contro 49,0±20 K/g Hb rispettivamente, n=18), che a sua volta aveva attività di catalasi più alte di uno studio molto precedente (di 31,3±9,6 K/g Hb).3±9,6 K/g Hb).33 Il produttore del kit G-6-PDH utilizzato cita un valore “normale” di 1,31±0,13 (media±SD) U/gHb che è paragonabile ai risultati ottenuti in questo studio di 1,32±0,7 U/g Hb.

Le proteine della fase acuta sono marcatori di malattia. Quelle misurate in questo studio sono note come proteine di fase acuta positive (cioè aumentano negli stati di malattia). Entrambi i livelli medi di alfa-1-antichimotripsina e di caeruloplasmina (proteina) rientravano negli intervalli di riferimento precedentemente stabiliti34 di 0,3-0,6 e 0,15-0,6 g/l, rispettivamente. Sono stati inoltre osservati come paragonabili a quelli di una coorte del braccio britannico dello studio EPIC,35 mentre le attività di caeruloplasmina ossidasi erano simili a quelle di un’indagine del 1994.36 La tabella 3 mostra che, nel complesso, gli enzimi antiossidanti del sangue cambiavano poco con l’età. Come previsto, le proteine della fase acuta (una misura dello stato infiammatorio) erano associate positivamente all’età. Entrambe le proteine della fase acuta hanno mostrato associazioni positive significative con l’abitudine al fumo. Solo la GPX ha dimostrato un’associazione significativa (negativa) con l’abitudine al fumo. È stato precedentemente dimostrato che le attività della GPX eritrocitaria sono più basse nei fumatori rispetto ai non fumatori,37 molto probabilmente riflettendo l’aumento dello stress ossidativo che si pensa si verifichi in questo gruppo, a causa dei radicali liberi presenti nel fumo.38 I risultati per la classe sociale hanno mostrato una tendenza all’aumento dello stato infiammatorio (come giudicato dai livelli crescenti delle proteine della fase acuta), con la diminuzione della classe sociale. La GPX è stato l’unico enzima a mostrare un’associazione significativa con la classe sociale, le attività sono diminuite nel gruppo manuale. Il BMI ha mostrato un modello simile agli altri fattori dello stile di vita esaminati, tuttavia, le associazioni non erano così forti. Le tendenze e le associazioni osservate per le classi sociali più basse non erano inaspettate, con circostanze ambientali e fattori di stile di vita come il fumo, la dieta, ecc. che probabilmente contribuiscono a livelli più elevati di infiammazione e a un aumento del BMI.

L’analisi fattoriale dei dati ha prodotto un modello a tre fattori che spiegava il 65,9% della variazione nel set di dati. Una serie di aspetti interessanti sono stati rivelati dall’analisi dei fattori. Il fattore 1 del modello riunisce tre misure che sono collegate attraverso meccanismi infiammatori. Il fattore 2 comprende due antiossidanti “principali”, cioè SOD e catalasi. L’osservazione che il fattore 3 è più strettamente associato a GPX e G-6-PDH è ciò che sarebbe previsto dalla teoria, poiché il secondo enzima produce cofattori ridotti per la riduzione del glutatione che, a sua volta, può essere utilizzato dal primo enzima. L’evidenza indica che il glucosio-6-fosfato è una molecola centrale nel metabolismo cellulare del glucosio che influenza criticamente l’attività del ciclo del pentoso fosfato e, attraverso la generazione di NADPH, regola l’attività della GPX per la disintossicazione dai radicali e anche la sintesi del colesterolo e dei trigliceridi.39

L’enzima Cu Zn SOD converte O2– in H2O2. La GPX dell’eritrocita può rimuovere l’H2O2 ad un tasso elevato e ossida il GSH a GSSG. Le GSSG possono essere ridotte a GSH dal NADPH prodotto dalla G-6-PD. La catalasi ha una capacità maggiore della GPX di distruggere l’H2O2 (prodotto, tra l’altro, dallo scoppio respiratorio dei neutrofili) scindendolo direttamente in H2O; in termini di molecole di H2O2 distrutte al minuto per molecola di enzima, è uno degli enzimi più attivi conosciuti. Tuttavia, la sua affinità per l’H2O2 è anche bassa, e richiede alte concentrazioni di H2O2 per un’elevata attività, trattando solo lentamente l’H2O2 a basse concentrazioni.

La molecola di H2O2 ha la capacità di attraversare facilmente le membrane cellulari e, se prodotta a livello extracellulare, può diffondersi nella cellula più vicina (compresi gli eritrociti) per il metabolismo da parte degli enzimi antiossidanti. Pertanto, gli eritrociti e altri tipi di cellule potrebbero fungere da “serbatoi” per l’H2O2. Questa interconnessione dei meccanismi di difesa antiossidanti combinata con gli indici di infiammazione (o stress ossidativo) può essere ciò che viene rappresentato nel modello a tre fattori. Questo supporta il concetto di un sistema di difesa antiossidante equilibrato e cooperativo nel sangue, che dipende dai livelli ottimali di un certo numero di sistemi antiossidanti piuttosto che dalla concentrazione o dall’attività di un singolo antiossidante, ma non preclude o diminuisce l’importanza di particolari antiossidanti, in particolari situazioni o condizioni.

In conclusione, i principali risultati di questo studio sono che la caeruloplasmina (totale e ossidasi) è aumentata nei fumatori solo nelle classi sociali inferiori. I cambiamenti nella caeruloplasmina si riflettevano nei cambiamenti nel reagente di fase acuta alfa-1-antichimotripsina, ed erano probabilmente legati all’infiammazione o allo stato di malattia. La GPX era l’unico enzima antiossidante a cambiare significativamente con lo stile di vita, aumentando con l’età, ma era più bassa nei fumatori e in quelli nelle classi socio-economiche più basse e con un BMI inferiore. Presi insieme, questi risultati indicano una diminuzione della protezione antiossidante parallelamente allo stress ossidativo/infiammatorio. L’analisi dei fattori ha prodotto un modello a tre fattori che spiega il 65,9% della variazione nel set di dati, che sembra indicare strette interrelazioni tra gli enzimi antiossidanti.