Sanes e Lichtman hanno usato l’iniezione pronucleare per inserire questi costrutti Brainbow nei topi. Quando hanno fotografato i cervelli dei topi, hanno trovato molti più di 3-4 colori a causa dell’integrazione in tandem di più copie del costrutto (circa 8 nei topi Brainbow-1.0.) L’effetto combinatorio di più eventi di ricombinazione indipendenti porta ad un arcobaleno di colori. Con tre copie del costrutto, ci si aspetterebbe dieci colori (vedi tabella a destra); in vari rapporti, Sanes e Lichtman hanno osservato da 90-160 colori distinti a causa del numero di copie più alto. Il nome Brainbow è veramente adatto a questa tecnologia colorata.
Ottimizzazione del sistema: Brainbow-3
Anche se Brainbow ha fornito ai neuroscienziati la vasta gamma di colori necessari per marcare i singoli neuroni, il sistema ha anche sofferto di una serie di limitazioni. In primo luogo, l’imaging del tessuto del topo Brainbow era impegnativo a causa della bassa intensità di fluorescenza, causata in parte da fotoinstabilità fluoroforo, così come la tendenza dei fluorofori di aggregare in somata dei neuroni. In secondo luogo, il sistema non ha permesso l’analisi tramite immunostaining. Anche se i fluorofori utilizzati sono fluorescentemente distinti, le loro sequenze proteiche sono altamente omologhe, impedendo la progettazione di anticorpi specifici per ogni fluoroforo. In terzo luogo, Brainbow-1 e Brainbow-2 ciascuno conteneva uno stato “predefinito”; per esempio, Brainbow-1.0 esprime RFP quando il costrutto non ha subito la ricombinazione. Questo stato predefinito era sproporzionatamente espresso da una maggioranza di neuroni, limitando il numero di colori distinti che potrebbero essere osservati in una data area.
Nel 2013, Dawen Cai, et al. rilasciato un perfezionamento della tecnologia Brainbow, Brainbow-3.0, con l’obiettivo di superare i limiti elencati sopra. In primo luogo, hanno vagliato una varietà di proteine fluorescenti per trovare quelle con caratteristiche ideali (bassa aggregazione, alta fotostabilità e alta stabilità dopo la fissazione). Dalle sette proteine risultanti, ne hanno scelte tre con bassi livelli di fluorescenza e sovrapposizione di sequenza (corallo mOrange2, medusa EGFP e anemone di mare mKate2.) Hanno poi generato con successo anticorpi personalizzati per ciascuna di queste proteine e confermato che non c’era cross-reattività, aprendo la porta all’analisi di immunostaining. Per ottenere un’etichettatura uniforme delle cellule, hanno generato derivati farnesilati delle proteine fluorescenti, che sono direttamente trafficate nelle membrane cellulari. Il traffico di membrana dei derivati farnesilati permette l’etichettatura di delicati processi assonali e dendritici non precedentemente visibili con Brainbow-1 e -2.
La struttura generale di Brainbow-1.0 è mantenuta in Brainbow-3.0, ma con mOrange2, EGFP e mKate2 come fluorofori; mOrange2 è lo stato predefinito. Al contrario, Brainbow-3.1 e -3.2 non mostrano la fluorescenza di default a causa dell’aggiunta della cassetta STOP che blocca la traduzione immediatamente dopo il promotore. La cassetta STOP include un YFP mutante che non diventa fluorescente, ma può essere rilevato tramite immunostaining. Questa caratteristica facilita lo screening di topi Brainbow Cre-negativi per determinare il numero e il tipo di cellule in cui il costrutto è espresso. La fotostabilità di Brainbow-3.2 è migliorata grazie all’aggiunta di un elemento regolatore post-trascrizionale del virus dell’epatite della marmotta (WPRE), comunemente usato per aumentare i livelli proteici del transgene.
Varianti di Brainbow e applicazioni oltre il cervello del topo
Oltre a migliorare il sistema Brainbow, Sanes e Lichtman hanno anche sviluppato un costrutto complementare Flpbow che è funzionalmente simile al Brainbow basato su Cre, ma è controllato dalla ricombinasi FLP/FRT. Quando posti sotto promotori diversi, Brainbow e Flpbow possono essere usati per etichettare popolazioni cellulari distinte.
Per diminuire l’allevamento necessario per produrre animali con transgeni Brainbow e Cre, Cai et al. hanno anche creato un costrutto Autobow contenente sia Cre che XFP. La produzione di Cre guida la ricombinazione e la selezione XFP, seguita dall’autoescissione Cre. Questi costrutti sono mantenuti stabilmente per almeno sei generazioni.
Oltre ai costrutti neuronali pThy1-Brainbow, Addgene ha anche due vettori virali adeno-associati Brainbow (AAV) disponibili – AAV-EF1a-BbChT e AAV-EF1a-BbTagBY. Questi costrutti contengono due XFP ciascuno a causa delle limitazioni di dimensione associate con AAV; co-infezione con entrambi i costrutti produce un minimo di 8 colori. L’uso di AAV fornisce il controllo spaziale e temporale senza la necessità di modifica della linea germinale e consente di utilizzare Brainbow in una varietà di specie.
Altre varianti sono state create da altri laboratori, tra cui R26R-Confetti descritto in Hugo J. Snippert, et al. (2010) e la strategia MAGIC Marker descritta in Karine Loulier, et al. (2014).
Oggi, le tecniche Brainbow vengono applicate anche per studiare organismi modello come Drosophila e zebrafish. Brainbow in Drosophila ha aiutato nella mappatura dei circuiti neurali, come le connessioni tra i motoneuroni e la giunzione neuromuscolare. Nel pesce zebra, il metodo è diventato molto utile per tracciare il lignaggio; “Zebrabow” è stato usato per tracciare lo sviluppo dell’epitelio corneale.
Per gli scienziati interessati alle neuroscienze e allo sviluppo, Brainbow è uno strumento prezioso per marcare e seguire singole cellule grazie alla vasta gamma e all’alta stabilità dei colori. Sanes e Lichtman stimano che l’etichettatura colorata di Brainbow ha diminuito il tempo di mappatura per una data sezione di cervello di almeno un ordine di grandezza. È chiaro che ulteriori perfezionamenti della tecnica Brainbow forniranno importanti intuizioni nella complicata organizzazione fisica del cervello e di altri sistemi biologici.
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- Brainbow 1.0, 1.1, 2.1 plasmidi
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Strategie transgeniche per l’espressione combinata di proteine fluorescenti nel sistema nervoso. Livet J, Weissman TA, Kang H, Bozza RW, Bennis RA, Sanes JR, Lichtman JW. Natura. 2007 Nov 1;450(7166):56-62. PubMed.
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L’omeostasi della cripta intestinale risulta dalla competizione neutrale tra le cellule staminali Lgr5 che si dividono simmetricamente. Snippert HJ, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, Barker N, Klein AM, van Rheenen J, Simons BD, Clevers H. Cell. 2010 Oct 1;143(1):134-44. PubMed.
Drosophila Brainbow: una tecnica di etichettatura di fluorescenza basata sulla ricombinazione per suddividere i modelli di espressione neurale. Hampel S, Chung P, McKellar CE, Hall D, Looger LL, Simpson JH. Natura Metodi. 2011 Mar;8(3):253-9. doi: 10.1038/nmeth.1566. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Flybow: etichettatura genetica multicolore delle cellule per l’analisi del circuito neurale in Drosophila melanogaster. Hadjieconomou D, Rotkopf S, Alexandre C, Bell DM, Dickson BJ, Salecker I. Natura Metodi. 2011 Mar;8(3):260-6. doi: 10.1038/nmeth.1567. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Strumenti migliorati per il toolbox Brainbow. Cai D, Cohen KB, Luo T, Lichtman JW, Sanes JR. Natura Metodi. 2013 maggio 5:10(6):540-7. doi: 10.1038/nmeth.2450. Epub 2013 maggio 5. PubMed.
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