Convex Arrhenius plotit ja niiden tulkinta

Viime vuosina yhä useammat tutkimukset ovat mitanneet entsyymireaktioiden lämpötilariippuvuutta sekä termostabiileille että mesostabiileille entsyymeille (entsyymejä, jotka ovat peräisin organismeista, jotka kasvavat optimaalisella tavalla korkeissa lämpötiloissa, ja jotka kasvavat optimaalisesti korkeissa lämpötiloissa ja vastaavasti normaaleissa ruumiinlämmössä). Lämpötilariippuvuus esitetään yleensä Arrheniuksen kuvaajana, joka on nopeuskertoimen luonnollinen logaritmi absoluuttisen lämpötilan käänteislukuna (kuva 1). Joitakin reaktionopeuksien lämpötilariippuvuuden mittausmenetelmiä on sovellettu myös katalysoitujen reaktioiden kineettisten isotooppivaikutusten (KIE) lämpötilariippuvuuden mittaamiseen, ja tällaiset kokeet tuottavat kokeellista tietoa, jolla on suuri merkitys reaktioiden dynaamisten pullonkaulojen kuvaamisessa (1-6). Tällaisten tietojen tulkitsemiseksi on kehitetty lukuisia teoreettisia malleja (7-19).

Kokeet erilaisilla termostabiileilla ja mesostabiileilla dehydrogenaasi- ja oksidaasi-entsyymeillä katalysoiduista reaktioista ovat osoittaneet, että joissakin tapauksissa kemiallista vaihetta kuvaava Arrhenius-kaavio on kovera (20-23). Tässä artikkelissa kommentoimme tämän havainnon merkitystä ja esitämme havainnolle tulkinnan, joka asettaa sen laajempaan näkökulmaan sekä ei-biologisen kemiallisen että biokemiallisen kinetiikan näkökulmasta. Tässä asiakirjassa huomautetaan, että kupera Arrheniuksen käyttäytyminen asettaa vakavan rajoituksen kemiallisen vaiheen mikrokanoniselle yksimolekyyliselle nopeuskertoimelle. Erityisesti voimme mennä pidemmälle kuin ilmeinen tulkinta, jonka mukaan kupera Arrheniuksen kuvaaja voidaan tulkita odotettua alhaisemmaksi nopeudeksi korkeissa lämpötiloissa, ja voimme tietyissä olosuhteissa sanoa, että kemiallisen vaiheen mikrokanonisen yksimolekyylisen nopeuskertoimen on itse asiassa pienennyttävä energian kasvaessa.

Yleisesti ottaen on toivottavaa erottaa kokeellisen datan tulkinta kahteen vaiheeseen. Ensin päätellään yleisiä seurauksia, jotka perustuvat vankkoihin perusteisiin, kuten termodynamiikkaan ja tilastollisen mekaniikan yleisiin periaatteisiin. Toiseksi siirrytään mikroskooppisesti yksityiskohtaisempiin malleihin, jotka eivät ole yhtä varmalla pohjalla. Tämän analyysin uusi näkökohta koskee yksinomaan ensimmäistä vaihetta.

Erikoinen piirre refs. 20-23, joita käsittelemme tässä, on niiden Arrhenius-diagrammien positiivinen kuperuus C, jossa 1 k(T) on katalyyttinen nopeuskerroin ja T on lämpötila. Kirjoitetaan 2 missä 3 Ea on lämpötilariippuvainen fenomenologinen aktivaatioenergia ja R on kaasuvakio. Positiivinen kuperuus tarkoittaa siis sitä, että Ea pienenee lämpötilan kasvaessa. Kinetiikan laajalla alalla, eikä tarkastelua rajoiteta entsyymikiinetiikkaan, kun voidaan havaita epälineaarisia Arrheniuksen kuvaajia, ne ovat lähes aina koveria, eli C on negatiivinen. Tämä yleinen tulos selittyy Tolmanin tulkinnalla aktivaatioenergiasta, joka voidaan kirjoittaa muodossa (25-27) 4 , jossa kaksinkertainen yliviiva tarkoittaa keskiarvoa kaikista reagoivista systeemeistä ja yksinkertainen yliviiva tarkoittaa keskiarvoa kaikista systeemeistä riippumatta siitä, reagoivatko ne vai eivät. Tolmanin yhtälön 4 mukaan Arrheniuksen kuvaajan paikallisen kaltevuuden negatiivinen arvo voidaan tulkita yhtä suureksi kuin reagoivien molekyylien keskimääräinen energia vähennettynä kaikkien mahdollisten reagoivien molekyylien keskimääräisellä energialla. Lämpötasapainossa olevan lajin yksimolekyylisissä reaktioissa: 5 ja 6 missä E on kokonaisenergia, dP/dE on normalisoitu todennäköisyystiheys sille, että systeemillä on energia E kanonisessa ensemblessa lämpötilassa T, ja k(E) on mikrokanonisen ensemblen yksimolekulaarinen nopeuskerroin energialla E.§ Yleensä E̿ kasvaa nopeammin kuin Ē T:n kasvaessa, koska k(E) on yleensä energian kasvava funktio.¶ Tämä selittää, miksi Ea yleensä kasvaa T:n kasvaessa ja miksi C on negatiivinen. Kupera Arrheniuksen kuvaaja tarkoittaa, että E̿ pienenee tai kasvaa vähemmän nopeasti kuin Ē lämpötilan kasvaessa, ja seuraavassa kappaleessa väitämme, että tämä merkitsee tavallisesti sitä, että k(E) pienenee energian kasvaessa sillä energia-alueella, joka dominoi yhtälön 6 integraaleja.

Voidaan esittää tarkempi lausuma siitä, mikä on seurausta siitä, että E̿ pienenee tai kasvaa vähemmän nopeasti kuin Ē lämpötilan kasvaessa. Huomioimalla, että 7 missä β on 1/RT ja ρ(E) on tilatiheys, ja käyttämällä yhtälöitä 4-6 voidaan helposti osoittaa, että 8 Näin ollen väite, että dEa/dT on negatiivinen, on sama kuin väite, että reaktion energioiden jakauma on kapeampi kuin reagoivien energioiden jakauma. Jos dP/dE olisi symmetrinen Ē:n suhteen, dEa/dT:n merkki riippuisi funktion k(E) muodosta eikä vain sen merkistä. Mutta dP/dE on itse asiassa erittäin vinoutunut funktio. Tyypillisille molekyyleille sen muotoa voidaan approksimoida hyvin asettamalla yhtälön 7 ρ(E) arvoksi En-1, jossa n on suunnilleen yhtä suuri kuin vapausasteiden lukumäärä (31). Jos oletetaan tämä muoto ja oletetaan myös, että k(E) vaihtelee hitaasti ja lineaarisesti yhtälön 6 integraalien tärkeällä alueella, voidaan osoittaa, että yhtälön 8 oikea puoli on verrannollinen dk/dE:hen positiivisella suhteellisuusvakioinnilla. Monimutkaisemmille k(E)-funktioille ei enää ole tarkkaa verrannollisuutta, mutta vaikutuksen suunta määräytyy dP/dE:n positiivisen vinouden perusteella. Vaikka dEa/dT:n ja dk/dE:n merkkien identtisyys ei ole matemaattinen teoreema, sen odotetaan pitävän paikkansa normaaleille tilatiheyksille ja sileille k(E)-funktioille.

Tämä tulos asettaa rajoituksia mille tahansa mikroskooppiselle tulkinnalle, ja – mikä yhtä tärkeää – se ehdottaa uusia mikroskooppisia tulkintoja. Oletetaan esimerkiksi, että reagoivan aineen konfiguraatioavaruus voidaan jakaa kahteen konformaatiotyyppiin, joista toinen (jota kutsutaan tyypiksi R) on reaktiivinen nopeuskertoimella kR(E) ja toinen (jota kutsutaan tyypiksi N) on ei-reaktiivinen nopeuskertoimella nolla. Sitten 9 missä PR(E) on ehdollinen todennäköisyys sille, että systeemi, jolla on energia E, on tyypin R konformaatiossa. Tämä tarjoaa mekanismin, jonka avulla k(E) pienenee E:n myötä, eli PR(E) pienenee E:n myötä nopeammin kuin kR(E) kasvaa. Tämä voi johtua siitä, että korkeamman energian systeemit käyvät laajemmalla alueella faasiavaruudessa ja viettävät siten pienemmän osan ajastaan millään yksittäisellä rajoitetulla alueella. Tämä tulkinta voi olla erityisen tärkeä entsymologian kannalta. Viime vuosina useissa tutkimuksissa on pyritty ymmärtämään konformaationäytteenoton merkitystä entsyymikatalyysissä (17, 18, 22, 32-37). Tuoreessa katsauksessa Bruice ja Benkovic (17) väittivät, että entsymaattisen kompleksin poimimat aktiiviset konfiguraatiot eivät ole korkeamman energian omaavia kuin konformaatioiden yleinen populaatio ja että näiden konformaatioiden asuttaminen voi määrittää reaktionopeuden. Toisin kuin edellä mainituissa artikkeleissa toisinaan esitetyissä yksityiskohtaisissa malleissa, tässä tulkinnassa edetään hyvin yleisillä perusteilla vetoamatta mihinkään tiettyyn mikroskooppiseen molekyylimekanismiin tai -malliin, kuten lämpöherkistyneen entsyymin fluktuaatioiden edistämään tunneloitumiseen (11, 13, 38, 39), aktivoitumisen vapaan energian laskelmiin, joihin sisältyy asianmukainen otos konformaatioista (40), tai erityisiin mekanismeihin, jotka koskevat siirtymiä konformaatioiltaan joustavuudeltaan vaihtelevien mikrotilojen välille (41-44). Siihen voidaan kuitenkin selvästi sisällyttää spesifisempiä tulkintoja, kuten proteiini, joka on jäykkä matalassa T:ssä, tai dynaaminen liike, joka edellyttää tiettyjen matalaenergisten värähtelytilojen populaatiota. Mikään tässä sanomamme ei kuitenkaan anna erityistä tukea tällaisille malleille, joiden paikkansapitävyyttä olisi tutkittava uusilla kokeilla ja yksityiskohtaisilla simulaatioilla. Tässä keskustelussa ei erityisesti viitata siirtymätilateorian hajoamiseen liittyviin vaikutuksiin. Kvantti-ilmiöt, kuten tunneloituminen, voidaan ottaa huomioon yksinkertaisesti sisällyttämällä ne k(E)- tai kR(E)-arvoihin.

Analyysimme yhteydessä edellä mainittuja tuloksia termofiilisen alkoholidehydrogenaasin ADH-hT:n (22, 32) osalta voidaan tulkita E̿:n ja Ē:n suhteellisten kehityssuuntien suhteen lämpötilaa muutettaessa. Yleisesti esitetty hypoteesi on, että termofiiliset entsyymit ovat kehittyneet toimimaan fysiologisella kapeikollaan eli korkeassa lämpötilassa ja ovat vähemmän aktiivisia huoneenlämmössä (joissakin tapauksissa jopa vähemmän aktiivisia kuin niiden fysiologisessa lämpötilassa aktivoitumisen entalpian perusteella odotetaan). Analyysimme voi tarjota yhteyden tämän käsityksen ja aktiivisten ja ei-aktiivisten konformaatioiden tunnistamiseen liittyvien laskelmien välille (16, 17). Esimerkiksi Wrba et al. (21) raportoivat empiirisen havainnon, jonka mukaan eri sulamislämpötiloja omaavilla entsyymeillä Arrheniuksen kaavioiden maksimikäyristymislämpötilojen ero on samanlainen kuin sulamislämpötilojen ero. Tämä voi liittyä PR(E)- ja kR(E)-riippuvuuksien siirtymiseen E:stä niillä alueilla, jotka ovat tärkeitä denaturoitumisen ja aktiivisuuden siirtymälämpötiloissa. Lisäesimerkkinä toteamme, että äskettäin esitettiin, että ”ei ehkä ole yllättävää, että C-H-sidosten pilkkoutumisreaktioissa lämpöenergian jakautuminen matalataajuisille proteiinimoodeille on merkittävä tekijä. Nämä moodit voivat kiihtyä merkittävästi ympäristön lämpötilassa, toisin kuin C-H-venytysmoodi, jonka odotetaan rajoittuvan suurelta osin nollapiste-energiatasolleen” (22). Tällaiset pohdinnat voivat liittyä E̿:n ja Ē:n lämpötilariippuvuuteen ja siten Arrheniuksen kuvaajien koveruuteen tai kuperuuteen.

Yleinen johtopäätös mikrokanonisen nopeuskertoimen energiariippuvuudesta on sovellettavissa myös kuperiin Arrheniuksen kuvaajiin, joita havaitaan toisinaan muissa tutkimuksissa. Jos näitä väitteitä aiotaan soveltaa, on oltava huolellinen sen varmistamisessa, että kupera Arrheniuksen kuvaaja edustaa todellista alkeisreaktiota, jossa reaktantit ovat sisäisesti tasapainossa. Esimerkiksi prototyyppisessä vakaan tilan ongelmassa 10 missä 11 kanssa 12 sitä voidaan soveltaa k1:een, k-1:een tai k2:een, mutta ei yleensä k:hon. Jos k-1 ja k1 ovat kuitenkin paljon suurempia kuin k2, k:sta tulee elementaarinen nopeuskerroin A → C:lle, eikä johtopäätökset muutu nopeutta määräävää vaihetta edeltävästä esitasapainosta. Tämä koskee myös tapausta, jossa k2 on paljon suurempi kuin k1 ja k-1, jolloin k:sta tulee k1. Erikoistapaus, jossa voidaan soveltaa pysyvän tilan lähestymistapaa, on tapaus, jossa A vastaa sitoutumatonta reaktanttia ja entsyymiä, tila B on Michaelis-kompleksi ja tila C on tuote (45). Huomaa, että tässä tapauksessa k1 (yhtälössä 12) pitäisi olla toisen kertaluvun nopeusvakio, joka johtaa Michaeliksen yhtälöön: 13 missä on reagoivan aineen (substraatin) konsentraatio, Vmax on reaktionopeus paljon suuremmalla KM:llä, joka on Michaelis-vakio, (k2 + k-1)/k1, yhtälön 10 osalta. Keskustelu ei koske efektiivisiä nopeuskertoimia, jotka johtuvat nopeutta määräävän vaiheen muutoksesta tai efektiivisen entsyymikonsentraation muutoksista, eikä nopeuskertoimia, joihin liittyy lasinmuodostuksesta johtuva hystereesi. Tätä seikkaa olisi korostettava entsymaattisten reaktioiden osalta: edustavatko mitatut nopeudet todella mielekästä johdonmukaista nopeusvakioarvoa koko lämpötila-alueella? Esimerkiksi Bacillus stearothermophilus -bakteerin (ADH-hT) termofiilisen alkoholidehydrogenaasin (ADH-hT) kuperan Arrheniuksen kuvaajan varhaisessa raportissa kaikki mittaukset suoritettiin samalla substraattikonsentraatiolla (joka tyydytti entsyymin huoneenlämmössä), ja Vmax esitettiin (47). Myöhemmässä raportissa (22) todettiin, että KM kasvaa lämpötilan myötä, joten korkeassa lämpötilassa KM ei ollut riittävän suuri, ja mitatun nopeuden todettiin olevan hitaampi kuin Vmax, ja siinä esitettiin ilmeisesti kupera Arrheniuksen kuvaaja. Jopa yksinkertaisimman realistisen entsyymikinetiikan osalta mekanismia 10 olisi täydennettävä tuotteen vapautumisvaiheella, ja tietoja olisi analysoitava ottaen asianmukaisesti huomioon sitoutuminen katalyysiin ja katalyysin suhde (48, 49); muutoin mitattu kcat voi osoittaa erilaista lämpötilariippuvuutta kuin itseisarvoinen k2. Viitteet 20-24 on valittu esimerkeiksi, joissa on kiinnitetty erityistä huomiota sen varmistamiseen ja osoittamiseen, että Arrheniuksen kuvaaja vastaa yhtä nopeutta rajoittavaa kemiallista alkeisreaktiovaihetta lämpötilan funktiona. Rubach ja Plapp (henkilökohtainen tiedonanto julkaisemattomista tuloksista) käyttivät esimerkiksi pysäytetyn virtauksen esivakiointitekniikoita mikroskooppisten nopeusvakioiden KIE:iden mittaamiseen tutkiakseen hevosen maksan alkoholidehydrogenaasin katalysoimaa reaktiota. He havaitsivat kuperia Arrheniuksen kuvaajia sekä hydridin että deuteridin siirrolle, mutta KIE:t eivät olleet riippuvaisia lämpötilasta, ja he osoittivat, että mikään muutos nopeutta määrittävässä vaiheessa ei todennäköisesti vaikuta heidän tuloksiinsa. Lisäksi suljimme pois tapaukset, joissa lämpötila-alue mahdollistaa palautumattomasti sulaneen tai osittain sulaneen proteiinin. Toisin kuin entsymaattisissa esimerkeissä, joissa on havaittavissa kuperaa Arrhenius-käyttäytymistä, johon liittyy yksi alkeisvaihe, mainitsemme lääkkeiden ihonläpäisevyyden, jossa on havaittu kuperaa Arrhenius-käyttäytymistä, mutta jossa alkeisvaiheita ei ole pystytty tai ei pystytä erottamaan (50, 51). Vertailuna ihon läpi tapahtuvaan permeaatioon mainitsemme myös, että hiukan paremmin määriteltyä tapausta, jossa diffuusio amorfisissa kiinteissä aineissa ei ole riippuvainen Arreniuksen lämpötilasta, on mallinnettu monivaiheisella site-hopping-mallilla (52, 53).

Esimerkki orgaanisesta kemiasta havainnollistaa hyödyllisellä tavalla näitä käsitteitä yhdessä lämpötilariippuvaisen rakenteellisen uudelleenjärjestelyn kanssa. Limbach on havainnut kuperia Arrheniuksen kuvaajia (henkilökohtainen tiedonanto julkaisemattomista tuloksista) emäksen katalysoimalle intramolekulaariselle protoninsiirrolle etyylimetyylieetteriin liuotetussa 1,3-bis-(4-fluorifenyyli)-triatseenissa. Nopeuskerroin edustaa keskiarvoa reagoivan aineen eri vetysidosmuodoista, erityisesti vapaasta molekyylistä ja emäksen kanssa muodostetusta kompleksista. Protoninsiirto tapahtuu kompleksissa. Kupera Arrheniuksen käyrä johtuu siitä, että molekyyli muuttuu korkeassa lämpötilassa kompleksittomaan muotoon, jossa protoninsiirron este on suurempi (viite 55 ja H. H. Limbach, henkilökohtainen tiedonanto). Näin ollen Tolmanin tulkinta ei varsinaisesti päde, koska nopeuskerroin ei edusta yksittäistä alkeisvaihetta. Kummankin muodon reaktiota erikseen kuvaava Arrheniuksen kuvaaja olisi oletettavasti kvasilineaarinen tai kovera. Jos eri vetysidonnaisia muotoja pidetään kuitenkin yhden reagoivan aineen konformereina, Tolmanin tulkintaa voidaan soveltaa, ja se havainnollistaa molekyyliä, joka reagoi hitaammin korkeammalla energialla, koska se tutkii laajempaa faasiavaruuden aluetta, joka sisältää olennaisesti ei-reaktiivisia konformereita. Vastaavasti Massey et al. (23) esittävät kuperan Arrhenius-kuvaajan mahdolliseksi selitykseksi kaksi kilpailevaa entsyymimuotoa, joista kumpikin hallitsee eri lämpötila-alueella. Tämä malli on yksi erityinen esimerkki mallista, joka voisi olla sopusoinnussa tässä esitetyn, mallista riippumattoman tuloksen kanssa. Ei-biologisissa reaktioissa odotamme, että erityisen reaktiiviset konfiguraatiot ovat usein korkean energian lajeja. On mahdollista, että kuperat Arrheniuksen kuvaajat ovat yleisempiä biologisissa systeemeissä, koska entsyymi on saattanut nimenomaan kehittyä siten, että matalaenergiset tilat (eli ne, joihin on helpoimmin pääsy ympäristön T:n lämpötilassa) ovat reaktiivisia, mikä johtaa alhaisiin E̿-arvoihin, vaikka T:n lämpötilaa nostetaan.

Konveksisia Arrheniuksen kuvaajia on havaittu myös diffuusiossa alijäähtyneissä nesteissä ja laseissa. Tällaiset tapaukset, kuten edellä mainittu ihon läpäisyongelma, voivat olla monimutkaisia useiden rinnakkaisten reittien vuoksi, mutta ne ovat kuitenkin antaneet mahdollisuuden yksityiskohtaiseen analyysiin. Yksi laajalti siteerattu selitys on, että matalalämpöisissä nesteissä molekyylit diffusoituvat ylittämällä huomattavia potentiaaliestejä, kun taas korkeissa lämpötiloissa diffuusioliikkeet ovat lähes vapaita (24, 56). Tässä mallissa tunnustetaan, että lämpötilan noustessa lämpöenergiat kasvavat suuremmiksi verrattuna esteiden korkeuksiin; kuperan Arrheniuksen kuvaajan edellytyksenä on, että siirtymiä tekevien molekyylien keskimääräinen energia (tässä tapauksessa diffuusiohyppy paikallisesta minimistä toiseen) nousee hitaammin kuin kaikkien molekyylien keskimääräinen energia. On olemassa monia yksityiskohtaisia teorioita metastabiileissa nesteissä ja laseissa esiintyvästä ei-Arrheniuksen käyttäytymisestä, joissa ei käsitellä nimenomaisesti aktivoitumisenergian lämpötilariippuvuutta Tolmanin tulkinnan mukaisesti (58), mutta minkä tahansa johdonmukaisen selityksen kuperasta Arrheniuksen kuvaajasta paikallisen tasapainon alkeisnopeuskertoimien avulla on oltava johdonmukainen Tolmanin tuloksen kanssa jollakin perimmäisellä tasolla, vaikkei tämä olisikaan nimenomaista tai vaikka sitä ei edes tunnistettaisi.

Yhteenvetona voidaan todeta, että tässä artikkelissa on tuotu esiin se perustavanlaatuinen mikrokanoninen informaatio, jonka Arrheniuksen kuvaajan kuperuuden havainto antaa, mutta jota ei ilmeisesti ole aiemmin tulkittu. Analyysi on laajalti sovellettavissa, ja se tekee selvän, mallista riippumattoman ennusteen siirtymiä tekevien systeemien keskimääräisistä energioista. Tulos on merkityksellinen kaikilla kinetiikan aloilla (entsyymeissä, ilmakehäkemiassa, klusterireaktioissa jne.), joilla voidaan havaita kuperia Arrheniuksen kuvaajia, ja sen vuoksi esitys on pidetty mahdollisimman yleisenä, mutta samalla on mainittu viimeaikaiset kokeet, jotka on tehty termostabiileilla ja mesostabiileilla dehydrogenaasi- ja oksidaasikatalysaattoreilla, erityisinä esimerkkeinä, joissa ilmiö esiintyy. Olemme myös ottaneet yhteyttä diffuusioteoriaan. Toivomme, että tässä artikkelissa esitetty näkökulma herättää uusia tapoja ajatella reaktionopeuksia, katalyysiä ja diffuusiota.

• Vastaanotettu 12. syyskuuta 2000.