Diagrammes d’Arrhenius convexes et leur interprétation

Ces dernières années, un nombre croissant d’études ont mesuré la dépendance à la température des réactions enzymatiques pour les enzymes thermostables et mésostables (enzymes provenant d’organismes qui se développent de manière optimale à haute température et à la température normale du corps, respectivement). La dépendance à la température est généralement présentée dans un diagramme d’Arrhenius, qui représente le logarithme naturel du coefficient de vitesse en fonction de l’inverse de la température absolue (figure 1). Certaines des méthodes de mesure de la dépendance en température des vitesses de réaction ont été appliquées pour mesurer également la dépendance en température des effets isotopiques cinétiques (EIC) des réactions catalysées, et ces expériences fournissent des données expérimentales très pertinentes pour caractériser les goulots d’étranglement dynamiques des réactions (1-6). Un grand nombre de modèles théoriques ont été avancés pour l’interprétation de ce type de données (7-19).

Des expériences sur des réactions catalysées par une variété d’enzymes déshydrogénases et oxydases thermostables et mésostables ont montré que dans certains cas, le plot d’Arrhenius pour l’étape chimique est convexe (20-23). Dans le présent article, nous commentons l’importance de cette observation et nous en donnons une interprétation qui la place dans la perspective plus large de la cinétique chimique et biochimique non biologique. Cet article souligne que le comportement convexe d’Arrhenius impose une contrainte sévère sur le coefficient de vitesse unimoléculaire microcanonique de l’étape chimique. En particulier, nous pouvons aller au-delà de l’interprétation évidente qu’un tracé d’Arrhenius convexe peut être interprété comme un taux plus faible que prévu à haute température, et nous pouvons dire, dans certaines conditions, que le coefficient de vitesse unimoléculaire microcanonique pour l’étape chimique doit en fait diminuer avec l’augmentation de l’énergie.

En général, il est souhaitable de séparer l’interprétation des données expérimentales en deux étapes. Premièrement, nous déduisons des conséquences générales qui reposent sur des bases solides telles que la thermodynamique et les principes généraux de la mécanique statistique. Ensuite, nous procédons à des modèles plus détaillés au niveau microscopique qui reposent sur des bases moins sûres. L’aspect nouveau de la présente analyse est entièrement concerné par la première étape.

La caractéristique frappante des réactions des réf. 20-23 que nous discutons ici est la convexité positive C de leurs graphiques d’Arrhenius, où 1 k(T) est le coefficient de vitesse catalytique, et T est la température. On écrit 2 où 3 Ea est l’énergie d’activation phénoménologique dépendant de la température, et R est la constante des gaz. Ainsi, une convexité positive signifie que Ea diminue avec l’augmentation de la température. Dans le vaste domaine de la cinétique, sans se limiter à la cinétique enzymatique, lorsque des diagrammes d’Arrhenius non linéaires peuvent être observés, ils sont presque toujours concaves, c’est-à-dire que C est négatif. Ce résultat général est expliqué par l’interprétation de Tolman de l’énergie d’activation, qui peut être écrite comme (25-27) 4 où une double barre supérieure dénote une moyenne sur tous les systèmes réagissant, et une simple barre supérieure dénote une moyenne sur tous les systèmes, qu’ils réagissent ou non. En d’autres termes, l’équation 4 de Tolman stipule que la négative de la pente locale d’un diagramme d’Arrhenius peut être interprétée comme égale à l’énergie moyenne des molécules qui réagissent moins l’énergie moyenne de tous les réactifs possibles. Pour les réactions unimoléculaires d’une espèce thermiquement équilibrée : 5 et 6 où E est l’énergie totale, dP/dE est la densité de probabilité normalisée qu’un système ait l’énergie E dans un ensemble canonique à la température T, et k(E) est le coefficient de vitesse unimoléculaire pour un ensemble microcanonique à l’énergie E.§ Habituellement, E̿ augmente plus rapidement que Ē avec l’augmentation de T parce que k(E) est généralement une fonction croissante de l’énergie.¶ Cela explique pourquoi Ea augmente généralement avec T et donc pourquoi C est négatif. Un tracé d’Arrhenius convexe signifie que E̿ diminue ou qu’il augmente moins rapidement que Ē lorsque la température augmente, et dans le paragraphe suivant, nous soutenons que cela implique ordinairement que k(E) diminue avec l’augmentation de l’énergie sur la région d’énergie qui domine les intégrales de l’équation 6.

On peut faire une déclaration plus précise sur la conséquence de E̿ diminuant ou augmentant moins rapidement que Ē lorsque la température augmente. En notant que 7 où β est 1/RT, et ρ(E) est la densité d’états, et en utilisant les équations 4-6, on peut facilement montrer que 8 Ainsi, l’affirmation que dEa/dT est négatif est la même que l’affirmation que la distribution des énergies de réaction est plus étroite que la distribution des énergies des réactifs. Si dP/dE était symétrique autour de Ē, alors le signe de dEa/dT dépendrait de la forme de la fonction k(E), et pas seulement de son signe. Mais dP/dE est en fait une fonction fortement asymétrique. Pour les molécules typiques, sa forme est bien approximée en fixant ρ(E) dans l’équation 7 égale à En-1, où n est approximativement égal au nombre de degrés de liberté (31). Si l’on adopte cette forme et que l’on suppose également que k(E) varie lentement et linéairement sur la plage importante des intégrales de l’équation 6, on peut montrer que le côté droit de l’équation 8 est proportionnel à dk/dE avec une constante de proportionnalité positive. Pour des fonctions k(E) plus compliquées, il n’y a plus de proportionnalité exacte, mais la direction de l’effet est établie par l’asymétrie positive de dP/dE. Bien que l’identité des signes de dEa/dT et dk/dE ne soit pas un théorème mathématique, on s’attend à ce qu’elle tienne pour des densités normales d’états et des fonctions k(E) lisses.

Ce résultat présente une contrainte sur toute interprétation microscopique, et – ce qui est tout aussi important – il suggère de nouvelles interprétations microscopiques. Par exemple, supposons que l’espace de configuration du réactif puisse être partitionné en deux types de conformations, dont l’une (appelée type R) est réactive avec un coefficient de taux kR(E) et l’autre (appelée type N) est non réactive avec un coefficient de taux nul. Alors 9 où PR(E) est la probabilité conditionnelle qu’un système ayant une énergie E soit dans une conformation de type R. Cela fournit un mécanisme pour que k(E) diminue avec E, c’est-à-dire que PR(E) diminue avec E plus rapidement que kR(E) n’augmente. Cela pourrait se produire parce que les systèmes à haute énergie visitent une région plus large de l’espace des phases et passent donc une fraction plus petite de leur temps dans une seule région contrainte. Cette interprétation peut revêtir une importance particulière pour l’enzymologie. Ces dernières années, plusieurs études ont cherché à comprendre le rôle de l’échantillonnage conformationnel dans la catalyse enzymatique (17, 18, 22, 32-37). Dans une revue récente, Bruice et Benkovic (17) ont soutenu que les configurations actives échantillonnées par le complexe enzymatique ne sont pas de plus haute énergie que la population générale de conformères et que le peuplement de ces conformations peut déterminer la vitesse de réaction. Contrairement aux modèles parfois détaillés des articles cités, la présente interprétation repose sur des bases très générales sans invoquer aucun mécanisme ou modèle moléculaire microscopique particulier, tel que l’effet tunnel favorisé par les fluctuations d’enzymes thermiquement excitées (11, 13, 38, 39), les calculs d’énergie libre d’activation incluant un échantillon approprié de conformations (40), ou des mécanismes spécifiques de transitions entre des micro-états de flexibilité conformationnelle variable (41-44). Néanmoins, elle peut clairement s’adapter à des interprétations plus spécifiques telles qu’une protéine qui est rigide à faible T ou un mouvement dynamique qui nécessite la population d’états vibrationnels spécifiques de faible énergie. Cependant, rien de ce que nous avons dit ici n’apporte un soutien spécifique à de tels modèles, dont la validité devrait être examinée par des expériences supplémentaires et des simulations détaillées. La présente discussion n’invoque pas spécifiquement les effets associés à la rupture de la théorie des états de transition. Les effets quantiques comme l’effet tunnel peuvent être pris en compte en les incluant simplement dans k(E) ou kR(E).

Dans le contexte de notre analyse, les résultats mentionnés ci-dessus pour l’alcool déshydrogénase thermophile ADH-hT (22, 32) peuvent être interprétés en termes de tendances relatives de E̿ et Ē lorsque la température est modifiée. Une hypothèse largement avancée est que les enzymes thermophiles ont évolué pour fonctionner dans leur niche physiologique, c’est-à-dire à température élevée, et sont moins actives à température ambiante (même moins actives, dans certains cas, que ce que prévoit leur enthalpie d’activation à température physiologique). Notre analyse peut offrir un lien entre cette notion et les calculs concernant l’identification des conformations actives et non actives (16, 17). Par exemple, Wrba et al. (21) ont rapporté une observation empirique selon laquelle, pour des enzymes ayant des températures de fusion différentes, la différence des températures de courbure maximale dans les diagrammes d’Arrhenius est similaire à la différence de température de fusion. Ceci peut être lié aux décalages des dépendances PR(E) et kR(E) par rapport à E dans les plages qui sont importantes aux températures de transition pour la dénaturation et l’activité. Comme exemple supplémentaire, nous notons qu’il a été récemment suggéré qu’il n’est « peut-être pas surprenant que, pour les réactions de clivage de la liaison C-H, un partage de l’énergie thermique en modes protéiques à basse fréquence soit un facteur majeur. Ces modes peuvent devenir significativement excités à la température ambiante, contrairement au mode d’étirement C-H, qui devrait être largement confiné à son niveau d’énergie du point zéro » (22). Ce genre de considérations peut être lié à la dépendance en température de E̿ et Ē et donc à la concavité ou à la convexité des tracés d’Arrhenius.

La conclusion générale sur la dépendance en énergie du coefficient de vitesse microcanonique est également applicable aux tracés d’Arrhenius convexes qui sont occasionnellement observés dans d’autres études. Si l’on veut appliquer ces arguments, il faut veiller à ce que le tracé d’Arrhenius convexe représente une véritable réaction élémentaire avec des réactifs en équilibre interne. Par exemple, dans le problème prototype de l’état d’équilibre 10 où 11 avec 12, il peut être appliqué à k1, k-1, ou k2, mais pas généralement à k. Cependant, si k-1 et k1 sont beaucoup plus grands que k2, alors k devient un coefficient de taux élémentaire pour A → C, et aucune conclusion n’est modifiée par le prééquilibre avant l’étape de détermination du taux. Ceci s’applique également au cas où k2 est beaucoup plus grand que k1 et k-1, où k devient k1. Un cas particulier où l’approche de l’état d’équilibre peut être appliquée est celui où A correspond au réactif et à l’enzyme non liés, l’état B est le complexe de Michaelis, et l’état C est le produit (45). Notez que dans ce cas, k1 (dans l’équation 12) devrait être une constante de vitesse de second ordre conduisant à l’équation de Michaelis : 13 où est la concentration du réactif (substrat), Vmax est la vitesse de réaction à un niveau bien supérieur à KM, qui est la constante de Michaelis, (k2 + k-1)/k1, pour l’équation 10. La discussion ne s’applique pas aux coefficients de vitesse effectifs résultant d’un changement de l’étape déterminant la vitesse ou aux changements de la concentration effective de l’enzyme, ni aux coefficients de vitesse avec hystérésis attribuables à la formation de verre. Ce point doit être souligné pour les réactions enzymatiques : les taux mesurés représentent-ils réellement une constante de taux cohérente et significative sur toute la gamme de température ? Par exemple, dans un premier rapport de tracé d’Arrhenius convexe pour l’alcool déshydrogénase thermophile de Bacillus stearothermophilus (ADH-hT), toutes les mesures ont été effectuées avec la même concentration de substrat (qui saturait l’enzyme à température ambiante), et le Vmax a été présenté (47). Un rapport ultérieur (22) a montré que la KM augmente avec la température, de sorte qu’à haute température, elle n’était pas suffisamment grande que la KM, et la vitesse mesurée s’est avérée être plus lente que Vmax, présentant un tracé d’Arrhenius apparemment convexe. Même pour la cinétique enzymatique réaliste la plus simple, le mécanisme 10 doit être complété par une étape de libération du produit, et les données doivent être analysées en tenant compte de l’engagement dans la catalyse et du rapport de catalyse (48, 49) ; sinon, le kcat mesuré peut présenter une dépendance à la température différente de celle du k2 intrinsèque. Les références 20-24 ont été choisies comme exemples où un soin particulier a été pris pour assurer et démontrer que le tracé d’Arrhenius correspond à une seule étape de réaction chimique élémentaire limitant la vitesse en fonction de la température. Rubach et Plapp (communication personnelle de résultats non publiés), par exemple, ont utilisé des techniques de pré-état stationnaire à écoulement arrêté pour mesurer les KIE sur les constantes de vitesse microscopiques afin d’étudier la réaction catalysée par l’alcool déshydrogénase du foie de cheval. Ils ont trouvé des courbes d’Arrhenius convexes pour le transfert d’hydrure et de deutéride, mais aucune dépendance de température des KIE, et ils ont démontré qu’aucun changement dans l’étape déterminant la vitesse n’était susceptible d’affecter leurs résultats. Nous avons également exclu les cas pour lesquels la plage de température permet une protéine irréversiblement fondue ou partiellement fondue. Contrairement aux exemples enzymatiques montrant un comportement d’Arrhenius convexe impliquant une seule étape élémentaire, nous mentionnons le cas de la perméation cutanée des médicaments, où un comportement d’Arrhenius convexe a été observé, mais où les étapes élémentaires n’ont pas été ou ne peuvent pas être triées (50, 51). Pour la comparaison avec la perméation à travers la peau, nous mentionnons également que le cas un peu mieux défini de dépendance à la température non-Arrhenius de la diffusion dans les solides amorphes a été modélisé par un modèle de saut de site à plusieurs étapes (52, 53).

Un exemple de la chimie organique fournit une illustration utile de ces concepts en conjonction avec une réorganisation structurelle dépendant de la température. Limbach a observé des courbes d’Arrhenius convexes (communication personnelle de résultats non publiés) pour le transfert intramoléculaire de protons catalysé par une base dans le 1,3-bis-(4-fluorophényl)-triazène dissous dans l’éther éthylméthylique. Le coefficient de vitesse représente une moyenne sur différentes formes de liaison hydrogène du réactif, en particulier la molécule libre et le complexe avec la base. Le transfert de protons a lieu dans le complexe. La courbure convexe d’Arrhenius provient du fait que la molécule se transforme à haute température en une forme non complexée où la barrière au transfert de protons est plus grande (réf. 55 et H. H. Limbach, communication personnelle). Ainsi, l’interprétation de Tolman ne s’applique pas strictement car le coefficient de vitesse ne représente pas une seule étape élémentaire. Le tracé d’Arrhenius de la réaction de l’une ou l’autre forme séparément serait vraisemblablement quasi-linéaire ou concave. Si, toutefois, les différentes formes liées à l’hydrogène sont considérées comme des conformères d’un seul réactif, l’interprétation de Tolman peut être appliquée, et elle fournit une illustration d’une molécule qui réagit plus lentement à une énergie plus élevée parce qu’elle explore une région plus large de l’espace de phase qui inclut des conformères essentiellement non réactifs. De même, Massey et al. (23) proposent une explication possible de leur tracé d’Arrhenius convexe impliquant deux formes enzymatiques concurrentes, chacune dominant dans une plage de température différente. Ce modèle est un exemple particulier d’un modèle qui pourrait être compatible avec le résultat indépendant du modèle présenté ici. Pour les réactions non biologiques, nous nous attendons à ce que les configurations particulièrement réactives soient souvent des espèces à haute énergie. Il est possible que les tracés d’Arrhenius convexes soient plus fréquents dans les systèmes biologiques parce qu’une enzyme peut avoir spécifiquement évolué de telle sorte que les états de plus basse énergie (c’est-à-dire les plus accessibles à T ambiante) sont les états réactifs, conduisant ainsi à une faible E̿ même lorsque T est augmentée.

Des tracés d’Arrhenius convexes ont également été observés pour la diffusion dans les liquides et les verres surfondues. Ces cas, comme le problème de la perméation cutanée mentionné ci-dessus, peuvent être compliqués par de multiples voies parallèles, mais ont néanmoins donné lieu à une analyse détaillée. Une explication largement citée est que les molécules dans les liquides à basse température diffusent en traversant des barrières de potentiel appréciables, alors qu’à haute température, les mouvements diffusifs sont presque libres (24, 56). Ce modèle reconnaît qu’à mesure que la température augmente, les énergies thermiques deviennent plus grandes par rapport aux hauteurs des barrières ; ce qui est requis pour un tracé d’Arrhenius convexe est que l’énergie moyenne des molécules effectuant des transitions (dans ce cas, des sauts diffusifs d’un minimum local à un autre) augmente plus lentement que l’énergie moyenne de toutes les molécules. Il existe de nombreuses théories détaillées du comportement non-Arrhenius dans les fluides et les verres métastables qui ne traitent pas explicitement de la dépendance de la température de l’énergie d’activation en termes d’interprétation de Tolman (58), mais toute explication cohérente d’un tracé d’Arrhenius convexe en termes de coefficients de vitesse élémentaires d’équilibre local doit être compatible avec le résultat de Tolman à un certain niveau sous-jacent, même si cela n’est pas explicite ou même pas reconnu.

En résumé, le présent article a souligné l’information microcanonique fondamentale qui est fournie par une observation de la convexité du tracé d’Arrhenius, mais qui n’a apparemment pas été interprétée auparavant. L’analyse a une large applicabilité et fait une prédiction définitive, indépendante du modèle, sur les énergies moyennes des systèmes en transition. Le résultat est pertinent pour tous les domaines de la cinétique (enzymatique, chimie atmosphérique, réactions en grappe, etc.) où des diagrammes d’Arrhenius convexes peuvent être observés, et nous avons donc gardé une présentation aussi générale que possible, tout en citant des expériences récentes avec des catalyseurs déshydrogénase et oxydase thermostables et mésostables comme exemples spécifiques présentant le phénomène. Nous avons également établi un lien avec la théorie de la diffusion. Nous espérons que le point de vue épousé dans cet article stimulera de nouvelles façons de penser aux taux de réaction, à la catalyse et à la diffusion.

• Reçu le 12 septembre 2000.