Frontiers in Pediatrics

Incidenza e prevalenza della calcolosi renale continuano ad aumentare nella popolazione generale. Con una prevalenza nell’arco della vita fino al 10%, la nefrolitiasi (NL) e la nefrocalcinosi (NC) sono quindi un peso importante per la salute, soprattutto nel mondo occidentale (1). La NL e la NC sono associate a una significativa morbilità e alla progressione verso la malattia renale cronica a causa delle recidive, dei ripetuti interventi chirurgici/endoscopici e dell’infiammazione concomitante. Ad un livello semplificato, la formazione di calcoli renali risulta da uno squilibrio degli inibitori urinari (ad esempio, citrato, magnesio, uromodulina e pirofosfato) e dei promotori (ad esempio, ossalato, calcio, fosfato, urato e cistina) della cristallizzazione, superando la supersaturazione con conseguente aggregazione, nucleazione e crescita dei calcoli nella placca di Randall (Figura 1). Questo squilibrio può essere dovuto a un’alterata gestione enterale e/o renale di promotori o inibitori, come la malsecrezione enterale di ossalato o il malassorbimento renale di calcio (Figura 1).

L’eziologia sottostante alla NL è ritenuta multifattoriale con una componente ambientale, alimentare, ormonale e genetica. Negli studi sui gemelli, l’ereditabilità dei calcoli renali è stata stimata al 56% (3), e fino a due terzi dei calcolatori ipercalciurici hanno parenti con NL (4). Anche se i calcoli renali contenenti calcio rappresentano più dell’80% di tutti, la base genetica di tali calcoli rimane in gran parte sconosciuta (5). Ad eccezione delle varianti in CLDN14, TRPV5, SLC34A1, ALPL, CASR, e UMOD, gli studi di associazione genomica non hanno ancora prodotto fattori genetici sostanziali (6-8). Tuttavia, gli alleli di rischio sono stati identificati all’interno di geni che sono stati anche trovati per trasmettere la malattia su base mendeliana, come CASR, SLC34A1 e SLC2A9 (9, 10). Ad oggi, più di 30 singoli geni con un fenotipo definito mendeliano online nell’uomo sono stati identificati per essere implicati nella NL/NC, se mutati (Tabella 1).

Le modalità di eredità nelle forme monogeniche includono la trasmissione autosomica dominante, autosomica recessiva e X-linked. È interessante notare che in molti di questi geni sono stati riportati sia modi di eredità recessivi che dominanti: SLC7A9, SLC34A1, SLC34A3, SLC2A9, SLC22A12 e SLC4A1. Mentre la maggior parte dei disturbi sindromici e congeniti gravi presentano un modello di eredità recessivo (Bartter, Lowe, Dent, FHHNC e acidosi tubulare renale distale con sordità neurosensoriale), le condizioni più lievi sono piuttosto associate a mutazioni nei geni dominanti. La maggior parte delle proteine codificate costituiscono trasportatori renali di soluti (ad esempio, SLC34A1, SLC34A3, e SLC9A3R1), ma anche canali del cloruro (CLCN5), proteine di giunzione stretta (ad esempio, CLDN16/CLDN19), ed enzimi metabolizzanti (ad esempio, AGXT, APRT, e CYP24A1) sono stati trovati difettosi in pazienti con NL/NC. Quindi, il difetto sottostante si trova principalmente nel sistema tubulare del rene stesso e può quindi essere attribuito come tubulopatia. Al contrario, condizioni extrarenali a priori, come nell’iperossaluria primaria (PH) in cui la disfunzione degli enzimi epatici (AGXT, GRHPR e HOGA1) causa un accumulo di ossalato con affezione renale secondaria, sono cause concepibili di NL/NC. Anche se ogni fenotipo di malattia è pensato per rappresentare un’entità relativamente rara, le cause monogeniche possono rappresentare un numero significativo di pazienti grazie alla loro ampia eterogeneità genetica (42). Oltre all’eterogeneità genetica, c’è anche una variazione allelica, dove le varianti troncanti provocano piuttosto una perdita di funzione e le varianti missense (ipomorfe) possono causare difetti piuttosto sottili, che possono essere clinicamente sorvegliati, specialmente nei calcolatori adulti. Un altro fenomeno recentemente apprezzato riguarda gli effetti del dosaggio genico in diversi dei geni della calcolosi renale sopra menzionati. In SLC34A3 per esempio, che codifica uno dei principali trasportatori di fosfato nel tubulo prossimale (NaPiIIc), è stato dimostrato che gli eterozigoti non possono più essere considerati semplicemente come portatori sani, poiché mostrano calcificazioni renali e/o manifestazioni ossee significativamente più frequenti rispetto agli individui wild-type; ma ancora in misura minore rispetto agli individui biallelici (omozigoti e eterozigoti composti) (43). Osservazioni simili sono state riportate per famiglie con mutazioni in CYP24A1 (44). Il contributo dei disordini monogenici alla prevalenza complessiva della calcolosi renale non è stato studiato in modo completo in passato. In particolare, mancano prove genetiche basate su ampi screening di una moltitudine di geni causali in grandi coorti di pazienti. I test genetici completi sono stati troppo costosi e inefficienti in passato. Per la maggior parte degli individui con NL/NC, l’analisi delle mutazioni per un difetto genetico causativo non è stata quindi accessibile, nonostante il fatto che la conoscenza della causa molecolare della NL/NC possa avere importanti conseguenze per la prognosi, la profilassi e/o il trattamento. Solo stime approssimative sono state ricavate da studi di osservazione clinica: sulla base di una vasta raccolta di dati di analisi della composizione dei calcoli, si è concluso che le cause monogeniche non superano il 9,6% nei bambini e l’1,6% negli adulti (45). Nell’ultimo decennio, tuttavia, questa situazione ha cominciato a cambiare, con l’avvento delle tecniche di sequenziamento high-throughput.

Analisi delle mutazioni high-throughput in pazienti con NL/NC

Per studiare i pazienti con calcolosi renale per la presenza di mutazioni patogene nei geni noti della malattia, abbiamo stabilito un pannello genico basato su microfluidica multiplex-PCR e sequenziamento NextGen consecutivo (Fluidigm™/NGS) (46, 47).

In uno “studio pilota”, abbiamo reclutato consecutivamente 268 individui geneticamente irrisolti da cliniche tipiche di calcoli renali; 102 pediatrici e 166 probandi adulti. Come risultato, abbiamo identificato 50 varianti deleterie in 14 dei 30 geni analizzati, portando a una diagnosi molecolare nel 15% dei casi. Nel sottogruppo pediatrico, abbiamo rilevato una mutazione causale nel 21%, mentre tra gli adulti, le varianti deleterie erano presenti nel 11% (Figura 2A) (48). Le mutazioni nel gene della cistinuria SLC7A9 sono state trovate più frequentemente nella coorte degli adulti (Figura 2B). Due studi di follow-up sono stati in grado di confermare questi risultati. In primo luogo, in una coorte esclusivamente pediatrica di 143 pazienti NL/NC, il 17% dei casi è stato spiegato da mutazioni in 14 geni diversi (49). In secondo luogo, in una coorte di 51 famiglie con età di manifestazione della NL/NC prima dei 25 anni, la WES mirata è stata utilizzata per individuare una causa genetica in quasi il 30% (50). Non sorprende che le mutazioni recessive siano state trovate più frequentemente tra i neonati e nei casi di malattia congenita, mentre le condizioni dominanti si sono solitamente manifestate più tardi nella vita. Questi dati indicano che la calcolosi renale genetica è una condizione sottodiagnosticata, nonostante il fatto che la diagnosi molecolare influenzerà potenzialmente la prognosi, la profilassi e/o il trattamento. Una limitazione che vale la pena menzionare, tuttavia, è un potenziale errore di selezione dovuto al reclutamento da cliniche specializzate in calcoli renali in tutti e tre gli studi citati.

Identificazione di nuovi geni di malattia umana da approccio del gene candidato

L’analisi di mutazione ad alta capacità è anche usato per lo screening di varianti patogene in vari geni candidati. Uno dei risultati recenti più interessanti è stata la scoperta di mutazioni umane in SLC26A1 (32). Dalla prima descrizione della formazione di calcoli renali di Ca-ossalato (CaOx) e NC in topi Slc26a1 (Sat1)-knockout da Dawson et al. nel 2010, SLC26A1 è stato un gene candidato bona fide NL (51). SLC26A1 codifica uno scambiatore di anioni espresso sulla membrana basolaterale dei tubuli renali prossimali, ileo e digiuno. Di conseguenza, utilizzando un approccio candidate-gene, sono state identificate varianti patogene in esseri umani con una storia di insorgenza precoce di CaOx-NL, ovvero due individui non imparentati con varianti missense bialleliche (32). Funzionalmente, la patogenicità delle varianti identificate è stata dimostrata in vitro, portando ad un mis-trafficking intracellulare e ad un’alterata attività di trasporto (32). Il difetto di SLC26A1 costituisce quindi una nuova causa di CaOx-NL e dovrebbe essere considerato quando si esaminano gli individui per le cause di formazione ricorrente di calcoli di CaOx.

Nuovo registro clinico dei pazienti per la calcolosi renale ereditaria

La maggior parte dei dati epidemiologici sull’aumento della prevalenza nei paesi occidentali deriva dai database statunitensi. Anche se urgentemente necessari, i database europei centralizzati non sono disponibili al momento. Dato che i suddetti studi genetici sulla prevalenza della calcolosi renale ereditaria sono stati eseguiti con piccole coorti di centri specializzati sia in Europa che negli Stati Uniti, una traduzione alla situazione generale in Europa non è valida. Mentre negli Stati Uniti, il Rare Kidney Stone Consortium costituisce una piattaforma che integra e coordina il registro, la scienza di base e le attività di ricerca clinica per condizioni rare come la cistinuria, il PH, il deficit di APRT, la malattia di Dent e Lowe, nessuna raccolta di dati comparabile sui pazienti con malattia renale ereditaria dei calcoli è stata implementata né in Europa né in Germania oggi. In collaborazione con l’esistente registro europeo PH, OxalEurope (Prof. Bernd Hoppe, Università di Bonn), e grazie al finanziamento della Deutsche Forschungsgemeinschaft e della Else Kröner-Fresenius Stiftung, abbiamo recentemente istituito un “Registro dei pazienti clinici per la calcolosi renale ereditaria” all’Università di Lipsia. Il registro è sostenuto a livello nazionale dalle società tedesche di nefrologia degli adulti (DGfN) e di nefrologia pediatrica (GPN). È inoltre iscritto al Registro tedesco degli studi clinici (DRKS-ID: DRKS00012891). Come parte fondamentale del reclutamento dello studio, l’analisi delle mutazioni ad alta produttività per i geni noti e nuovi della calcolosi renale è offerta su una base di ricerca per i pazienti senza una diagnosi molecolare stabilita ma con un quadro clinico che indica una suscettibilità genetica sottostante: ad esempio, età precoce di insorgenza (<40 anni), storia familiare positiva, fenotipi indicativi come NC, cistinuria, o RTA, e NL gravemente ricorrente (>3×) (Tabella 2). Mentre i pazienti con una diagnosi genetica già stabilita vengono generalmente arruolati, i casi con cause secondarie di NL/NC, come la malignità, la sarcoidosi e l’iperparatiroidismo primario, non vengono inclusi nell’analisi genetica. Per arruolare attivamente i pazienti, un centro clinico avrà solitamente bisogno dell’approvazione da parte dell’Institutional Review Board locale; un processo per il quale offriamo il nostro aiuto e assistenza fornendo i rispettivi modelli. Dopo l’approvazione etica, il modulo di consenso e i fogli di dati clinici (ad esempio, il questionario clinico) possono essere scaricati dal nostro sito web del registro (http://www.mks-registry.net). Per garantire un’accurata fenotipizzazione clinica, chiederemo informazioni sostanziali sul paziente come etnia, consanguineità, storia familiare, età di insorgenza, recidiva (definita come ogni evento putativo di calcoli renali), assunzione giornaliera di liquidi, interventi chirurgici e coinvolgimento extrarenale, tra gli altri. I documenti possono essere compilati dal paziente con l’aiuto del medico arruolatore. Inoltre, i parametri biochimici del siero, tra cui creatinina, eGFR, PTH, vitamina D, elettroliti, acido urico, e l’analisi delle urine (pH, calcio, fosfato, magnesio, acido urico, citrato, ossalato, e cistina, preferibilmente dalle urine delle 24 ore, se non dalle urine spot), così come i dati sull’analisi della composizione dei calcoli saranno richiesti al momento dell’arruolamento. Tenendo conto del fatto che la raccolta delle urine a 24 ore e l’analisi della composizione dei calcoli non vengono eseguite di routine in tutte le istituzioni, includiamo questi parametri se disponibili. Le visite di follow-up clinico a 2 anni dei pazienti arruolati sono auspicabili ma non obbligatorie. Dopo la registrazione, i centri clinici che reclutano riceveranno un login personalizzato per inserire i dati dei pazienti tramite il nostro sito web del registro (http://www.mks-registry.net). In alternativa, offriamo la possibilità di inserire i dati elettronicamente quando ci vengono inviati su carta. I dati inseriti saranno memorizzati su un server protetto e vi potranno accedere i centri clinici partecipanti per visualizzare i dati dei loro pazienti. I seguenti siti web forniscono ulteriori informazioni:

https://www.dgfn.eu/hereditaere-nierensteinleiden.html

https://www.drks.de/drks_web/navigate.do?navigationId=trial.HTML&TRIAL_ID=DRKS00012891

In sintesi, la malattia dei calcoli renali è una condizione sempre più prevalente che è clinicamente eterogenea e poco compresa, in particolare i suoi driver genetici. Come indicato da una serie di studi recenti, le condizioni monogeniche sono molto probabilmente sottostimate nella prevalenza. Con l’implementazione di un registro centralizzato dei pazienti sulla calcolosi renale ereditaria, contribuiremo a superare, almeno in parte, la vasta lacuna di conoscenze sulla genetica della calcolosi renale. In questo contesto, i registri clinici sono fonti preziose per diverse ragioni: in primo luogo, delineare meglio le associazioni fenotipo-genotipo sarà fondamentale per una più precisa stratificazione dei pazienti nei futuri studi di ricerca clinica. In secondo luogo, l’identificazione di nuovi geni della malattia con nuovi meccanismi di malattia diminuirà la lacuna dell’eziologia sconosciuta della NL/NC; e in terzo luogo, la decifrazione di nuovi bersagli molecolari aiuta ad aprire la strada allo sviluppo di farmaci di prevenzione delle recidive nelle famiglie gravemente colpite.

Dichiarazione etica

Questo studio è stato condotto in conformità alle raccomandazioni della “Ethikkommission an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig” con consenso informato scritto da tutti i soggetti. Tutti i soggetti hanno dato il consenso informato scritto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Il protocollo è stato approvato dalla “Ethikkommission an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig.”

Contributi degli autori

JH ha concepito e scritto il manoscritto. BH, AS, LM e RS hanno curato il manoscritto e costruito l’infrastruttura del registro che viene presentata al lettore.

Dichiarazione di conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Finanziamento

La ricerca è finanziata da sovvenzioni di progetto da DFG (HA 6908/2-1) e EKFS (2016_A52) a JH. Questo lavoro è stato ulteriormente sostenuto dal Ministero federale dell’istruzione e della ricerca (BMBF), Germania, FKZ: 01EO1501 a JH.