DNS-metiltranszferázok (MTázok), amelyek metilcsoportot visznek át S-adenozil-metioninról adenin- vagy citozin-maradékokra, számos prokariótában és eukariótában megtalálhatók. A metilációt figyelembe kell venni a DNS restrikciós endonukleázokkal történő emésztésekor, mivel a hasítás blokkolódhat vagy károsodhat, ha a felismerőhely egy adott bázisa metilálódik.
Prokarióta metiláció
A prokariótákban a MTázokat leggyakrabban a restrikciós/módosító rendszerek elemeiként azonosították, amelyek a gazdaszervezet DNS-ét védik a megfelelő restrikciós endonukleáz általi hasítástól. Az E. coli legtöbb laboratóriumi törzse három helyspecifikus DNS-metilázt tartalmaz.
- Dam-metiláz-metilálás az adenin N6 pozíciójában a GATC szekvenciában (1,2).
- Dcm-metiltranszferázok-metilálás a második citozin C5 pozíciójában a CCAGG és CCTGG szekvenciákban (1,3).
- EcoKI-metiláz-metilálás az adenin metilálása az AAC(N6)GTGC és GCAC(N6)GTT szekvenciákban.
Egy restrikciós endonukleáz egyes vagy összes helye rezisztens lehet a hasítással szemben, ha a Dam vagy Dcm metilázokat expresszáló törzsekből izolálják, ha a metiláz felismerő helye átfedésben van az endonukleáz felismerő helyével. Például a Dam+ E. coliból izolált plazmid DNS teljesen rezisztens a GATC-helyeken hasító MboI általi hasítással szemben.
Nem minden E. coliból izolált DNS metilálódik azonos mértékben. Míg a pBR322 DNS teljesen módosított (és ezért teljesen ellenálló az MboI emésztésével szemben), addig a λ DNS Dam helyeknek csak kb. 50%-a metilálódik, feltehetően azért, mert a metiláznak nincs lehetősége a DNS teljes metilálására, mielőtt az a fágfejbe csomagolódik. Ennek eredményeképpen a Dam vagy Dcm módosítással blokkolt enzimek részleges emésztési mintázatot adnak a λ DNS-sel.
A Dam vagy Dcm metilációval blokkolt korlátozó helyek metilálását fel lehet oldani, ha a DNS-t egy dam-, dcm- E. coli törzsbe, például dam-/dcm- kompetens E. coli (NEB #C2925) klónozzuk.
A korlátozó helyek akkor is blokkolhatók, ha van egy átfedő hely. Ebben az esetben a Dam vagy Dcm szekvencia egy részét a restrikciós enzim szekvenciája, majd a flankáló szekvencia generálja. Ezt a helyzetet is figyelembe kell venni a restrikciós enzimes emésztések tervezésekor.
Eukarióta metiláció
A magasabb eukariótákban található CpG MTázok (pl. Dnmt1) metilcsoportot visznek át a citozinmaradványok C5 pozíciójába. A CpG-metiláció mintázata öröklődik, szövetspecifikus és korrelál a génexpresszióval. Következésképpen a CpG-metilációról feltételezik, hogy szerepet játszik a differenciálódásban és a génexpresszióban (4).
Megjegyzés: A CpG-metiláció hatásai elsősorban az eukarióta genomiális DNS feltárása során jelentenek gondot. A CpG-metilációs minták nem maradnak meg, ha a DNS-t bakteriális gazdaszervezetbe klónozzuk.
Metilációs érzékenység
Az alábbi táblázat összefoglalja a NEB restrikciós enzimek metilációs érzékenységét, jelezve, hogy a Dam, Dcm vagy CpG metiláció blokkolja vagy akadályozza-e a hasítást, ha vagy amikor átfedésben van az egyes felismerési helyekkel. Ezt a táblázatot inkább a felsorolt enzimek viselkedésére vonatkozó útmutatónak kell tekinteni, mint abszolút mutatónak. A REBASE , a restrikciós enzimek adatbázisa részletesebb információkat és konkrét példákat tartalmaz, amelyeken ezek az iránymutatások alapulnak.
- Marinus, M.G. és Morris, N.R. (1973) J. Bacteriol. 114, 1143-1150. PMID: 4576399
- Geier, G.E. és Modrich, P. (1979) J. Biol. Chem. 254, 1408-1413. PMID: 368070
- May, M.S. és Hattman, S.(1975) J. Bacteriol. 123, 768-770. PMID: 1097428
- Siegfried, Z. és Cedar, H. (1997) Curr. Biol. 7, r305-307. PMID: 9115385
Legend
| ● | Nem érzékeny | ◆ | Károsult. |
| ◼ | Blokkolt | ◇ ol | Károsodott az átfedés miatt |
| ◻. ol | Blokkolták az átfedések | ◇ scol | Károsították az átfedések egyes kombinációi |
| ◻ scol | Blokkolták az átfedések egyes kombinációi | ||
Egybetűs kód.