Konvex Arrhenius-diagramok és értelmezésük

Az utóbbi években egyre több tanulmány mérte az enzimreakciók hőmérsékletfüggését mind a termostabil, mind a mezostabil enzimek (magas hőmérsékleten, illetve normál testhőmérsékleten optimálisan fejlődő szervezetekből származó enzimek) esetében. A hőmérsékletfüggést általában egy Arrhenius-diagramon ábrázolják, amely a sebességi együttható természetes logaritmusát mutatja az abszolút hőmérséklet reciprokának függvényében (1. ábra). A reakciósebességek hőmérsékletfüggésének mérésére szolgáló módszerek egy részét alkalmazták a katalizált reakciók kinetikai izotóphatásának (KIE) hőmérsékletfüggésének mérésére is, és az ilyen kísérletek nagyon fontos kísérleti adatokat szolgáltatnak a reakciók dinamikai szűk keresztmetszeteinek jellemzéséhez (1-6). Az ilyen jellegű adatok értelmezésére számos elméleti modell született (7-19).

A különböző termostabil és mezostabil dehidrogenáz és oxidáz enzimek által katalizált reakciókon végzett kísérletek azt mutatták, hogy egyes esetekben a kémiai lépésre vonatkozó Arrhenius-diagram konvex (20-23). Jelen tanulmányban ennek a megfigyelésnek a jelentőségét kommentáljuk, és olyan értelmezést adunk ennek a megállapításnak, amely a nem biológiai kémiai, valamint a biokémiai kinetika tágabb perspektívájába helyezi. Ez a dolgozat rámutat arra, hogy a konvex Arrhenius-viselkedés komoly korlátot állít a kémiai lépés mikrokanonikus egymolekuláris sebességi együtthatójára. Különösen, túlléphetünk azon a nyilvánvaló értelmezésen, hogy a konvex Arrhenius-ábrát úgy értelmezhetjük, mint a vártnál alacsonyabb sebességet magas hőmérsékleten, és bizonyos feltételek mellett azt mondhatjuk, hogy a kémiai lépésre vonatkozó mikrokanonikus egymolekuláris sebességi együtthatónak valójában csökkennie kell az energia növekedésével.

Általában kívánatos a kísérleti adatok értelmezését két lépésre szétválasztani. Először általános következtetéseket vonunk le, amelyek olyan szilárd alapokon nyugszanak, mint a termodinamika és a statisztikus mechanika általános elvei. Másodszor, továbblépünk a mikroszkopikusan részletesebb modellekhez, amelyek kevésbé biztos alapokon nyugszanak. A jelen elemzés új aspektusa teljes egészében az első lépéssel foglalkozik.

A refs. 20-23, amelyeket itt tárgyalunk, az Arrhenius-diagramjaik C pozitív konvexitása, ahol 1 k(T) a katalitikus sebességi együttható, és T a hőmérséklet. Írjuk 2 ahol 3 Ea a hőmérsékletfüggő fenomenológiai aktiválási energia, és R a gázállandó. A pozitív konvexitás tehát azt jelenti, hogy az Ea a hőmérséklet növekedésével csökken. A kinetika széles területén, nem korlátozva a megfontolást az enzimkinetikára, amikor nemlineáris Arrhenius-diagramok figyelhetők meg, azok szinte mindig konkávok, azaz C negatív. Ezt az általános eredményt az aktiválási energia Tolman-féle értelmezése magyarázza, amely a következőképpen írható fel: (25-27) 4 ahol a dupla felső oszlop az összes reagáló rendszerre vonatkozó átlagot, az egyszerű felső oszlop pedig az összes rendszerre vonatkozó átlagot jelöli, függetlenül attól, hogy reagálnak-e vagy sem. Szavakkal Tolman 4. egyenlete kimondja, hogy az Arrhenius-diagram helyi meredekségének negatívja úgy értelmezhető, hogy az egyenlő a reagáló molekulák átlagos energiájával mínusz az összes lehetséges reagáló molekula átlagos energiája. Egy termikusan egyensúlyban lévő faj egymolekuláris reakciói esetén: 5 és 6 ahol E a teljes energia, dP/dE a normalizált valószínűségi sűrűség, hogy egy rendszer E energiájú egy kanonikus együttesben T hőmérsékleten, és k(E) az E energiájú mikrokanonikus együttesre vonatkozó egymolekuláris sebességi együttható.§ Általában E̿ gyorsabban nő, mint Ē a T növekedésével, mert k(E) általában az energia növekvő függvénye.¶ Ez megmagyarázza, hogy Ea általában miért nő a T-vel, és ezért C miért negatív. A konvex Arrhenius-diagram azt jelenti, hogy E̿ a hőmérséklet növekedésével csökken vagy kevésbé gyorsan nő, mint Ē, és a következő bekezdésben azt állítjuk, hogy ez általában azt jelenti, hogy k(E) az energia növekedésével csökken a 6. egyenlet integráljait uraló energia tartományban.

Pontosabban is kijelenthetjük, hogy mi a következménye annak, hogy E̿ a hőmérséklet növekedésével csökken vagy kevésbé gyorsan nő, mint Ē. Megjegyezve, hogy 7 ahol β 1/RT, ρ(E) pedig az állapotsűrűség, és a 4-6. egyenletek segítségével könnyen megmutathatjuk, hogy 8 Így az az állítás, hogy dEa/dT negatív, megegyezik azzal az állítással, hogy a reakcióenergiák eloszlása szűkebb, mint a reaktáns energiák eloszlása. Ha a dP/dE Ē körül szimmetrikus lenne, akkor a dEa/dT előjele nem csak az előjelétől, hanem a k(E) függne a k(E) függvény alakjától is. A dP/dE azonban valójában egy erősen ferde függvény. Tipikus molekulák esetén alakja jól közelíthető, ha a 7. egyenletben ρ(E) értékét En-1-nek adjuk meg, ahol n körülbelül egyenlő a szabadságfokok számával (31). Ha ezt a formát vesszük fel, és azt is feltételezzük, hogy k(E) lassan és lineárisan változik a 6. egyenletben szereplő integrálok fontos tartományában, akkor megmutathatjuk, hogy a 8. egyenlet jobb oldala pozitív arányossági állandóval arányos dk/dE-vel. Bonyolultabb k(E) függvények esetén már nem rendelkezünk pontos arányossággal, de a hatás irányát a dP/dE pozitív ferdeksége határozza meg. Bár a dEa/dT és dk/dE előjelének azonossága nem matematikai tétel, normális állapotsűrűségek és sima k(E) függvények esetén várhatóan érvényes.

Ez az eredmény korlátot jelent minden mikroszkopikus értelmezésre, és – ami ugyanilyen fontos – új mikroszkopikus értelmezéseket javasol. Tegyük fel például, hogy a reaktáns konfigurációs terét kétféle konformációra lehet felosztani, amelyek közül az egyik (R típusnak nevezett) reaktív kR(E) sebességi együtthatóval, a másik (N típusnak nevezett) pedig nem reaktív nulla sebességi együtthatóval. Akkor 9 ahol PR(E) annak a feltételes valószínűsége, hogy egy E energiájú rendszer az R típusú konformációban van. Ez egy mechanizmust biztosít arra, hogy k(E) csökkenjen E-vel, azaz PR(E) gyorsabban csökken E-vel, mint kR(E) nő. Ez azért fordulhat elő, mert a magasabb energiájú rendszerek a fázistér szélesebb régióját látogatják, és így idejük kisebb hányadát töltik egyetlen korlátozott régióban. Ez az értelmezés különösen fontos lehet az enzimológia szempontjából. Az elmúlt években számos tanulmány foglalkozott a konformációs mintavételezés szerepének megértésével az enzimkatalízisben (17, 18, 22, 32-37). Egy nemrégiben megjelent áttekintésben Bruice és Benkovic (17) azzal érvelt, hogy az enzimkomplex által mintavételezett aktív konfigurációk nem rendelkeznek magasabb energiával, mint a konformerek általános populációja, és hogy e konformációk benépesítése meghatározhatja a reakció sebességét. Az idézett cikkekben szereplő, olykor részletes modellekkel ellentétben a jelen értelmezés nagyon általános alapokon nyugszik, anélkül, hogy bármilyen konkrét mikroszkopikus molekuláris mechanizmusra vagy modellre hivatkozna, mint például a termikusan gerjesztett enzim fluktuációi által elősegített alagútépítés (11, 13, 38, 39), az aktivációs szabadenergia-számítások, beleértve a megfelelő mintát a konformációk felett (40), vagy a különböző konformációs rugalmasságú mikroállapotok közötti átmenetek specifikus mechanizmusai (41-44). Mindazonáltal egyértelműen befogadhat specifikusabb értelmezéseket is, mint például egy olyan fehérje, amely alacsony T-nél merev, vagy egy olyan dinamikus mozgás, amely specifikus alacsony energiájú rezgési állapotok populációját igényli. Azonban semmi, amit itt elmondtunk, nem ad konkrét támogatást az ilyen modelleknek, amelyek érvényességét további kísérletekkel és részletes szimulációkkal kell megvizsgálni. A jelen értekezés nem hivatkozik kifejezetten az átmeneti állapotok elméletének összeomlásával kapcsolatos hatásokra. Az olyan kvantumhatások, mint az alagutazás, egyszerűen figyelembe vehetők, ha a k(E) vagy kR(E)-be beleszámítjuk őket.

Az elemzésünk keretében a termofil alkohol-dehidrogenáz ADH-hT (22, 32) esetében fent említett eredmények a hőmérséklet változtatásakor az E̿ és Ē relatív trendjei szempontjából értelmezhetők. Egy széles körben elterjedt hipotézis szerint a termofil enzimek úgy fejlődtek ki, hogy fiziológiai fülkéjükben, azaz emelkedett hőmérsékleten működjenek, és szobahőmérsékleten kevésbé aktívak (egyes esetekben még annál is kevésbé aktívak, mint amit az aktiválási entalpiájuk fiziológiás hőmérsékleten feltételezne). Elemzésünk kapcsolatot teremthet e felfogás és az aktív és nem aktív konformációk azonosításával foglalkozó számítások között (16, 17). Wrba és munkatársai (21) például arról az empirikus megfigyelésről számoltak be, hogy különböző olvadási hőmérsékletű enzimek esetében az Arrhenius-ábrákon a maximális görbület hőmérsékletének különbsége hasonló az olvadási hőmérséklet különbségéhez. Ez összefügghet a PR(E) és kR(E) E-től való függésének eltolódásával azokban a tartományokban, amelyek a denaturáció és az aktivitás szempontjából fontos átmeneti hőmérsékleteken fontosak. További példaként megjegyezzük, hogy nemrégiben felvetették, hogy “talán nem meglepő, hogy a C-H-kötéses hasadási reakciók esetében a termikus energia alacsony frekvenciájú fehérjemódokba történő felosztása a fő tényező. Ezek a módusok környezeti hőmérsékleten jelentősen gerjesztetté válhatnak, ellentétben a C-H nyújtási módussal, amely várhatóan nagyrészt a nullponti energiaszintjére korlátozódik” (22). Az ilyen jellegű megfontolások összefüggésbe hozhatók az E̿ és Ē hőmérsékletfüggésével, és így az Arrhenius-diagramok konkáv vagy konvexitásával.

A mikrokanonikus sebességi együttható energiafüggésére vonatkozó általános következtetés a más vizsgálatokban alkalmanként megfigyelhető konvex Arrhenius-diagramokra is alkalmazható. Ha ezeket az érveket alkalmazni akarjuk, ügyelnünk kell arra, hogy a konvex Arrhenius-diagram valódi elemi reakciót ábrázoljon belsőleg egyensúlyban lévő reaktánsokkal. Például a 10 ahol 11 a 12 prototípus állandósult állapotú problémában k1, k-1 vagy k2 esetén alkalmazható, de általában nem k-ra. Ha azonban k-1 és k1 sokkal nagyobb, mint k2, akkor k elemi sebességi együtthatóvá válik A → C esetén, és a sebességmeghatározó lépés előtti előegyensúly nem változtatja meg a következtetéseket. Ez vonatkozik továbbá arra az esetre is, amikor k2 sokkal nagyobb, mint k1 és k-1, ahol k k1 lesz. Egy speciális eset, amikor az állandósult állapot megközelítése alkalmazható, az, amikor A megfelel a nem kötött reaktánsnak és az enzimnek, B állapot a Michaelis-komplex, C állapot pedig a termék (45). Megjegyzendő, hogy ebben az esetben a k1-nek (a 12. egyenletben) másodrendű sebességi állandónak kell lennie, ami a Michaelis-egyenlethez vezet: 13 ahol a reaktáns (szubsztrát) koncentrációja, Vmax a reakciósebesség a KM-nél jóval nagyobb értéken, ami a Michaelis konstans, (k2 + k-1)/k1, a 10. egyenlethez. Az értekezés nem vonatkozik a sebességet meghatározó lépés változásából eredő effektív sebességi együtthatókra vagy az effektív enzimkoncentráció változására , sem pedig az üvegképződésnek tulajdonítható hiszterézissel rendelkező sebességi együtthatókra. Ezt a pontot hangsúlyozni kell az enzimatikus reakciók esetében: a mért sebességek valóban egy értelmes, konzisztens sebességállandót képviselnek a teljes hőmérséklettartományban? Például a Bacillus stearothermophilusból származó termofil alkohol-dehidrogenáz (ADH-hT) konvex Arrhenius-diagramjának egy korai jelentésében az összes mérést azonos szubsztrátkoncentrációval végezték (ami szobahőmérsékleten telítette az enzimet), és a Vmax értéket mutatták be (47). Egy későbbi jelentés (22) megállapította, hogy a KM a hőmérséklettel nő, így magas hőmérsékleten nem volt eléggé nagyobb, mint a KM, és a mért sebesség lassabbnak bizonyult, mint a Vmax, látszólag konvex Arrhenius-diagramot mutatva. Még a legegyszerűbb reális enzimkinetika esetén is a 10. mechanizmust ki kell egészíteni egy termékfelszabadítási lépéssel, és az adatokat a katalízisre való elkötelezettség és a katalízis arányának figyelembevételével kell elemezni (48, 49); ellenkező esetben a mért kcat más hőmérsékletfüggést mutathat, mint a belső k2. A 20-24. hivatkozások olyan példákként lettek kiválasztva, ahol különös gondot fordítottak annak biztosítására és bizonyítására, hogy az Arrhenius-diagram egyetlen sebességkorlátozó elemi kémiai reakciólépésnek feleljen meg a hőmérséklet függvényében. Rubach és Plapp (személyes közlés a nem publikált eredményekről) például a lómáj alkohol-dehidrogenáz által katalizált reakció tanulmányozásához a mikroszkopikus sebességállandókra vonatkozó KIE-k méréséhez megállított áramlás előtti állandósult állapotú technikákat használtak. Mind a hidrid-, mind a deuterid-átvitelre vonatkozóan konvex Arrhenius-ábrákat találtak, de a KIE-k nem függtek a hőmérséklettől, és kimutatták, hogy a sebességet meghatározó lépés megváltoztatása valószínűleg nem befolyásolja eredményeiket. Kizártuk továbbá azokat az eseteket, amelyeknél a hőmérséklet-tartomány irreverzibilisen megolvadt vagy részben megolvadt fehérjét tesz lehetővé. Az egyetlen elemi lépést tartalmazó, konvex Arrhenius viselkedést mutató enzimatikus példákkal szemben megemlítjük a gyógyszerek bőrpermeációjának esetét, ahol konvex Arrhenius viselkedést figyeltek meg, de az elemi lépéseket nem sikerült vagy nem lehetett elkülöníteni (50, 51). A bőrön keresztüli permeációval való összehasonlításként megemlítjük azt is, hogy az amorf szilárd anyagokban történő diffúzió nem-Arrhenius hőmérsékletfüggésének valamivel jobban meghatározott esetét egy többlépéses site-hopping modellel modellezték (52, 53).

Egy szerves kémiai példa jól szemlélteti ezeket a fogalmakat a hőmérsékletfüggő szerkezeti átrendeződéssel összefüggésben. Limbach konvex Arrhenius-diagramokat figyelt meg (személyes közlés a nem publikált eredményekről) az etil-metil-éterben oldott 1,3-bisz-(4-fluorfenil)-triazol bázis-katalizált intramolekuláris protonátvitelére vonatkozóan. A sebességi együttható a reaktáns különböző hidrogénkötésű formáira, különösen a szabad molekulára és a bázissal alkotott komplexre vonatkozó átlagot jelenti. A protonátvitel a komplexben történik. A domború Arrhenius-görbület abból adódik, hogy a molekula magas hőmérsékleten átvált a nem komplex formába, ahol a protonátvitel gátja nagyobb (55. hivatkozás és H. H. Limbach, személyes közlés). Így a Tolman-értelmezés nem alkalmazható szigorúan, mivel a sebességi együttható nem egyetlen elemi lépést képvisel. A reakció Arrhenius-diagramja bármelyik formából külön-külön feltehetően kvázilineáris vagy konkáv lenne. Ha azonban a különböző hidrogénkötésű formákat egyetlen reaktáns konformereinek tekintjük, akkor a Tolman-értelmezés alkalmazható, és ez egy olyan molekula illusztrációját adja, amely magasabb energiával lassabban reagál, mert a fázistér szélesebb régióját vizsgálja, amely lényegében nem reaktív konformereket is tartalmaz. Hasonlóképpen Massey és munkatársai (23) a konvex Arrhenius-diagramjuk lehetséges magyarázatát javasolják, amely két egymással versengő enzimatikus formát foglal magában, amelyek mindegyike más-más hőmérsékleti tartományban dominál. Ez a modell egy konkrét példa egy olyan modellre, amely összhangban lehet az itt bemutatott modellfüggetlen eredménnyel. A nem biológiai reakciók esetében azt várjuk, hogy a különösen reaktív konfigurációk gyakran nagy energiájú fajok lesznek. Lehetséges, hogy a biológiai rendszerekben gyakoribbak lesznek a konvex Arrhenius-diagramok, mert egy enzim kifejezetten úgy fejlődött ki, hogy a legalacsonyabb energiájú állapotok (azaz a környezeti T-nél leginkább elérhető állapotok) a reaktívak, ami a T növelésével is alacsony E̿ értéket eredményez.

Konvex Arrhenius-diagramokat figyeltek meg a túlhűtött folyadékokban és üvegekben történő diffúzió esetén is. Az ilyen esetek, hasonlóan a fent említett bőrpermeációs problémához, több párhuzamos útvonal miatt bonyolultak lehetnek, de ennek ellenére részletes elemzésre adtak lehetőséget. Az egyik gyakran idézett magyarázat szerint az alacsony hőmérsékletű folyadékokban a molekulák diffúziója jelentős potenciálgátak átlépésével történik, míg magas hőmérsékleten a diffúziós mozgások szinte szabadok (24, 56). Ez a modell elismeri, hogy a hőmérséklet emelkedésével a termikus energiák nagyobbak lesznek a gátak magasságához képest; a konvex Arrhenius-diagramhoz az szükséges, hogy az átmeneteket (ebben az esetben diffúziós ugrásokat az egyik lokális minimumból a másikba) végző molekulák átlagos energiája lassabban emelkedjen, mint az összes molekula átlagos energiája. A metastabil folyadékok és üvegek nem-Arrhenius viselkedésének számos részletes elmélete létezik, amelyek nem foglalkoznak kifejezetten az aktiválási energia hőmérsékletfüggésével a Tolman-féle értelmezés értelmében (58), de a konvex Arrhenius-ábrának a helyi egyensúlyi elemi sebességi együtthatókkal kapcsolatos bármilyen következetes magyarázatának valamilyen mögöttes szinten összhangban kell lennie Tolman eredményével, még akkor is, ha ez nem explicit vagy nem is ismert.

Összefoglalva, a jelen cikk rámutatott arra az alapvető mikrokanonikus információra, amelyet az Arrhenius-diagram konvexitásának megfigyelése szolgáltat, de amelyet nyilvánvalóan korábban nem értelmeztek. Az elemzés széleskörűen alkalmazható, és határozott, modellfüggetlen előrejelzést tesz az átmenetet végző rendszerek átlagos energiáira vonatkozóan. Az eredmény a kinetika minden olyan területére vonatkozik (enzimek, légköri kémia, klaszterreakciók stb.), ahol konvex Arrhenius-diagramok figyelhetők meg, ezért a lehető legáltalánosabbnak tartottuk az ismertetést, miközben a jelenséget bemutató konkrét példaként termostabil és mezostabil dehidrogenáz- és oxidáz-katalizátorokkal végzett legújabb kísérleteket idézzük. Kapcsolatot teremtettünk a diffúzió elméletével is. Reméljük, hogy az ebben a dolgozatban képviselt nézőpont új gondolkodásmódra ösztönöz a reakciósebességekről, a katalízisről és a diffúzióról.

• Beérkezett 2000. szeptember 12-én.