Abstract
L’eziologia delle malattie neurodegenerative (ND) sembra coinvolgere geni di suscettibilità e fattori ambientali. I metalli tossici sono considerati importanti inquinanti ambientali. A seguito del nostro studio di un caso di sclerosi multipla (MS) miglioramento a causa della rimozione di alluminio (Al) e altri metalli tossici, abbiamo esaminato la possibile relazione tra intossicazione Al e ND. Abbiamo usato il trattamento endovenoso lento con l’agente chelante EDTA (calcio disodio etilene diamina tetraacetico) (test di chelazione) per rimuovere Al e rilevato nelle urine raccolte dai pazienti per 12 ore. I pazienti affetti da MS rappresentavano 85.6% del totale ND. Al era presente in 44.8% dei casi completi di ND e pazienti sani. Livelli di Al erano significativamente più alti nei pazienti ND rispetto ai soggetti sani. Qui dimostriamo che il trattamento di pazienti affetti da Al carico con dieci terapie di chelazione EDTA (EDTA somministrazione endovenosa una volta alla settimana) è stato in grado di ridurre significativamente Al intossicazione.
1. Introduzione
L’esposizione delle popolazioni umane a metalli tossici può provocare danni a una varietà di sistemi di organi.
Uno dei metalli più comunemente tossici studiati, alluminio (Al), è implicato in molte malattie. L’Al è un tossico ambientale e industriale molto abbondante e ubiquitariamente distribuito ed è anche contenuto in molti prodotti alimentari, essendo coinvolto in malattie scheletriche, ematologiche e neurologiche. La tossicità dell’Al è causata dalla perturbazione dell’omeostasi di metalli come magnesio, calcio e ferro (Fe): infatti, l’Al imita questi metalli nelle loro funzioni biologiche e innesca molte alterazioni biochimiche. In particolare, l’Al esercita una genotossicità diretta nelle cellule neurali umane primarie e induce la neurodegenerazione, attraverso un aumento dell’accumulo di Fe e della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Il danno ossidativo al DNA indotto dall’Al è stato precedentemente associato alla neurodegenerazione in diverse regioni del cervello di ratto. Inoltre, più recentemente Al3+ ha dimostrato di provocare la degenerazione dei neuroni della dopamina mediata dal trasportatore nel nematode Caenorhabditis elegans.
La rimozione del metallo tossico dal corpo umano può rappresentare un utile strumento per evitare l’inizio o la progressione di molte malattie legate all’intossicazione da metallo.
I metodi utili per determinare alcuni contenuti di metallo in campioni biologici a scopo di monitoraggio sono stati sviluppati alcuni anni fa. Infatti, sia i metalli tossici che quelli essenziali sono stati dosati nel sangue, nelle urine e nei capelli mediante spettroscopia di assorbimento atomico. Successivamente, i metodi per l’analisi degli elementi in traccia nei materiali biologici umani sono stati sviluppati e la spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS) è stata considerata preferibile per lo screening di più elementi. Tuttavia, sembra difficile mostrare l’eccesso di metallo nel sangue e nelle urine in condizioni diverse dall’intossicazione acuta da metallo. Infatti, l’aumento dei metalli tossici nel sangue riflette solo l’esposizione recente ai metalli. Dopo l’esposizione acuta, i metalli tossici si spostano rapidamente dal sangue a molti tessuti, dove sono sequestrati, come nel sistema nervoso centrale (SNC). L’unico modo in grado di rimuovere i metalli tossici accumulati dagli organi umani è quello di legare questi metalli per mezzo di agenti chelanti, con lo scopo di formare complessi in grado di essere escreti nelle urine. I livelli di metalli tossici possono essere esaminati nei campioni di urina raccolti dai pazienti, dopo la “sfida” con un agente chelante (“test di chelazione”). Abbiamo selezionato, tra gli agenti chelanti conosciuti, l’acido disodico etilendiammina tetraacetico di calcio (CaNa2EDTA o EDTA), che è stato somministrato per via endovenosa. Le costanti di stabilità di alluminio e altri metalli di interesse biochimico con vari agenti chelanti tra cui EDTA sono stati precedentemente studiati. Lo sviluppo di una serie di costanti di complessi metallici è servito a correlare le proprietà chimiche e funzionali dei metalli e ha suggerito che EDTA era in grado di mobilitare l’alluminio.
In passato, i livelli tossici di Al sono stati associati a malattie neurodegenerative (ND). Un possibile legame tra Al e il morbo di Alzheimer è stato evidenziato. Nel 1991, il trattamento con basse dosi di desferrioxamina intramuscolare (DFO), un chelante trivalente in grado di rimuovere l’eccesso di ferro e/o alluminio dal corpo, è stato segnalato per rallentare la progressione della malattia di Alzheimer.
Nel presente lavoro abbiamo deciso di studiare se Al fosse coinvolto nella neurotossicità. Infatti abbiamo valutato il carico corporeo di Al in pazienti affetti o meno da ND. Abbiamo studiato anche la possibile riduzione di questo carico a seguito di trattamenti con l’agente chelante EDTA.
2. Materiali e metodi
2.1. Disegno dello studio e reclutamento dei pazienti
Su 471 soggetti consecutivi che si erano sottoposti a un controllo medico in un centro medico ambulatoriale, solo 211 sono stati selezionati e arruolati per questo studio a causa dell’evidenza del loro carico di Al e della conformità nel seguire il protocollo, per esempio, ricevendo la terapia chelante una volta alla settimana per scelta personale. La ND esaminata in questo studio erano sclerosi multipla (MS), sclerosi laterale amiotrofica (ALS), malattia di Parkinson (PD) e malattia di Alzheimer (AD). Molti pazienti con SM erano stati precedentemente trattati con farmaci convenzionali utilizzati in tale patologia (ad esempio, agenti immunosoppressori, come mitoxantrone e azatioprina, agenti immunomodulatori ad ampio spettro, come glatiramer acetato e interferone, e anticorpi monoclonali, come rituximab e natalizumab). Alcuni pazienti con SM non erano mai stati trattati in precedenza con farmaci. Sono stati reclutati anche pazienti non affetti da malattie note (soggetto sano o controlli) così come pazienti affetti da patologie non neurodegenerative (non ND, che si riferisce a malattie non classificate come ND come fibromialgia). Alcuni pazienti sani che erano stati precedentemente esposti a metalli tossici ambientali o di lavoro hanno preferito esaminare la loro possibile intossicazione valutando la presenza di tali metalli nei campioni di capelli. Infatti, sono stati esclusi dal presente studio. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato a partecipare a questo studio. Avevano un’età compresa tra 18 e 75 anni.
2.2. Test di chelazione e valutazione delle urine Al
I pazienti sono stati sottoposti al test di chelazione per mostrare una possibile intossicazione da Al. Infatti, sono stati invitati a raccogliere i campioni di urina prima e dopo il trattamento endovenoso con l’agente chelante EDTA (acido etilendiammino tetraacetico, ad esempio, edetato disodico di calcio, 2 g/10 mL diluito in 500 mL di soluzione fisiologica, Farmax srl, Brescia, Italia). L’EDTA è stato somministrato lentamente per via endovenosa ai pazienti (l’infusione è durata circa 2 ore). Il tempo di raccolta delle urine dopo la chelazione è durato 12 h. I campioni recuperati da tale raccolta sono stati accuratamente avvolti in fiale sterili e trasportati al Laboratorio di Tossicologia (Doctor’s Data Inc., St. Charles, IL, USA), dove sono stati elaborati. I campioni sono stati digeriti con acidi certificati privi di metalli; la digestione è avvenuta in un sistema di digestione a microonde a vaso chiuso. Per la diluizione dei campioni è stata utilizzata acqua ultrapura.
Per evitare la contaminazione, sono stati utilizzati solo materiali plastici. Tutto il materiale di laboratorio (puntali per pipette, matracci volumetrici, ecc.) è stato immerso per almeno 48 ore in una soluzione di HNO3/etanolo al 10% (v/v) e, poco prima dell’uso, lavato con acqua purificata Milli-Q. Per evitare la contaminazione dall’aria, tutte le fasi di preparazione dei campioni e dei reagenti sono state eseguite su un banco pulito di classe 100.
I test sono stati eseguiti tramite spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS) utilizzando metodi di collisione/cella di reazione accoppiati alla chimica delle molecole ioniche, un nuovo metodo affidabile per la riduzione delle interferenze. Il metodo è stato recentemente utilizzato per il biomonitoraggio di 20 elementi in tracce nel sangue e nelle urine di lavoratori esposti per motivi professionali. Standard di urina certificati e standard interni sono stati utilizzati per il controllo di qualità e per convalidare i risultati. Per evitare il margine di errore potenzialmente elevato che può derivare dall’assunzione di liquidi e dal volume del campione, i risultati sono stati riportati in microgrammi (μg) per g di creatinina. La creatinina è stata misurata mediante cromatografia liquida ad alta prestazione in fase inversa ed è stata utilizzata per correggere il volume totale di Al urinario per le differenze nei tassi di filtrazione glomerulare degli individui al momento del campione spot. Il programma di ricerca intitolato “Effetti della terapia chelante con EDTA in pazienti affetti da patologie legate all’esposizione (acuta o cronica) a metalli tossici” è stato approvato dal Comitato Etico dell’Università di Milano (Italia) (numero 64/2014).
2.3. Valutazione clinica del miglioramento dei sintomi del paziente nella SM
In assenza di un test diagnostico specifico per la SM, la comunità neurologica ha adottato criteri diagnostici che sono stati sostituiti nel tempo . La risonanza magnetica (RM), l’analisi del liquido cerebrospinale e il potenziale evocato visivo, aggiunti alla diagnosi clinica, sono stati considerati presentare limiti di sensibilità e specificità. Successivamente, la risonanza magnetica ha acquisito una certa importanza. Tuttavia, la diagnosi di miglioramento dei sintomi del paziente è attualmente basata su criteri clinici, come la riduzione della disabilità neurologica (parestesia, atassia dell’andatura, spasticità, neurite ottica e disfunzione vescicale) e la fatica. A volte, i sintomi della SLA, come paresi, atrofia muscolare e disartria, sono associati ad anomalie della risonanza magnetica e del liquido cerebrospinale tipiche della SM. Infatti, abbiamo considerato il miglioramento dei sintomi del paziente il recupero della disabilità clinica, per esempio, la capacità di lavorare, la riduzione della spasticità, il ritardo delle ricadute, e/o la scomparsa della fatica.
2.4. Effetto della terapia chelante EDTA su Al intossicazione
I pazienti che hanno rivelato intossicazione Al (dall’esame dei suoi livelli nei campioni di urina) sono stati sottoposti a terapia chelante EDTA. L’EDTA (2 g in 500 mL di soluzione fisiologica) è stato infuso per via endovenosa in ogni paziente in circa 2 ore. Il trattamento è stato somministrato una volta alla settimana ed è durato dieci settimane. Alla fine dei trattamenti sono stati analizzati i livelli di Al nelle urine, come precedentemente descritto.
2.5. Analisi dei dati
L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando Microsoft Excel 2010 e IBM SPSS Statistics 20 (IBM Armonk, New York, USA). Un’analisi di regressione logistica è stata utilizzata per esaminare i contributi relativi di diverse variabili ai risultati dell’operazione. è stato considerato significativo.
3. Risultati
3.1. Caratteristiche dei pazienti
La figura 1 riporta la distribuzione dei pazienti che hanno mostrato intossicazione da Al.
Schema delle caratteristiche dei soggetti arruolati.
I pazienti più rappresentati affetti da ND sono stati quelli con SM (85,6% del totale ND). Infatti, abbiamo confrontato sia il gruppo di pazienti con SM che il gruppo di pazienti con ND con il gruppo di pazienti sani.
3.2. Al Intoxication
Tutti i pazienti non hanno mostrato intossicazione da Al prima della sfida EDTA (dati non mostrati). Tutti i pazienti affetti da ND hanno mostrato intossicazione da diversi metalli tossici (dati non mostrati). Dopo la sfida con EDTA, Al era presente in 44.8% dei casi completi di ND e pazienti sani. I livelli di intossicazione Al, come ottenuto dalla valutazione del contenuto μg/g creatinina di Al nei campioni di urina raccolti dopo il primo trattamento endovenoso con EDTA (test di chelazione), sono riportati nella Figura 2. I dati indicano che i valori di Al erano significativamente più alti nei campioni di urina dei pazienti SM e ND rispetto a quelli dei pazienti sani.
Livelli di alluminio (Al) valutati nei campioni di urina dei soggetti esaminati, dopo il test di chelazione (scuro) e dopo dieci terapie di chelazione con EDTA (chiaro), espressi come media ± SEM di μg/g creatinina. I soggetti studiati erano pazienti sani, pazienti affetti da sclerosi multipla (MS) e pazienti affetti da tutte le malattie neurodegenerative (ND). I livelli di Al in entrambi i pazienti con SM e ND erano significativamente più alti rispetto a quelli ottenuti nei soggetti sani dopo il test di chelazione (rispetto ai sani). Dopo le terapie di chelazione con EDTA, i livelli di Al erano significativamente inferiore a quello ottenuto dopo il test di chelazione (# contro e ## contro).
3.3. Utilità della terapia chelante EDTA
L’effetto della terapia chelante EDTA è riportato anche nella figura 2. Infatti, i pazienti che hanno mostrato intossicazione da Al dopo il test di chelazione sono stati sottoposti a terapia chelante (somministrazione di EDTA per via endovenosa una volta alla settimana). Dopo dieci terapie, i livelli di Al nei campioni di urina sono stati ulteriormente valutati e confrontati con quelli ottenuti dopo il test di chelazione. La somministrazione di EDTA ha dimostrato di essere significativamente efficiente nella rimozione del carico di Al, come mostrato nella Figura 2. I nostri risultati hanno mostrato che la riduzione del tempo di intossicazione da Al ben collegato con il miglioramento delle condizioni cliniche dei pazienti. Infatti hanno presentato, in misura diversa, la riduzione della disabilità neurologica e fatica.
Notevolmente, l’efficacia della terapia chelante EDTA era più evidente in ND che in pazienti sani.
4. Discussione
I metalli tossici, pesticidi e fenoli sono considerati importanti inquinanti ambientali. I metalli tossici sono classificati come sostanze non biodegradabili, così come la plastica e i detergenti, perché non vengono degradati dai microrganismi. Essi rappresentano un rischio globale per la salute a causa della loro capacità di contribuire a una varietà di malattie. In questo contesto, l’Al (che è un elemento altamente reattivo e un contaminante ambientale onnipresente) è stato associato ad alcune malattie. Infatti, l’osteomalacia è una malattia scheletrica legata agli effetti tossici dell’Al, come la carenza di fosfato, l’alterazione del Ca-uptake e la proliferazione disfunzionale degli osteoblasti. Inoltre, l’esposizione ad Al può compromettere l’assorbimento intestinale di Fe, promuovendo uno stato anemico. Inoltre, Al può svolgere un ruolo attivo nei meccanismi patogenetici delle malattie neurologiche. In particolare, Al ha dimostrato di essere responsabile di lesioni neuropatologiche critiche in AD e altri disturbi correlati per la sua capacità di cross-link proteine iperfosforilate. Al è stato rilevato nelle fibre amiloidi nei nuclei delle placche senili nel cervello dei pazienti AD. La presenza di Al nei sistemi biologici potrebbe portare ad un’importante attività pro-ossidante, promuovendo la generazione di superossido attraverso la reazione di Fenton. Più recentemente, la rimozione dell’Al nei pazienti con AD mediante trattamento con DFO è stata ulteriormente proposta. Il trattamento con successo con DFO (sia a basso che a dose standard) è stato eseguito per il sovraccarico di Al tra i pazienti in emodialisi. Inoltre, DFO ha dimostrato di essere in grado di esercitare effetti protettivi nel tessuto cerebrale dei topi contro Al-indotta alterazioni strutturali e metaboliche. Tuttavia, poiché alcuni pazienti possono avere intolleranza al DFO o sviluppare effetti collaterali DFO come reazioni allergiche, sintomi neurologici, o evidenti disturbi gastrointestinali, abbiamo deciso di utilizzare EDTA come agente chelante. Il chelante N-(2-idrossietil) etilendiammina acido triacetico (HEDTA), simile a EDTA, ha dimostrato di essere efficace, anche in associazione con il selenio, contro lo stress ossidativo indotto da Al nel cervello di ratto .
L’escrezione urinaria elevata di Al e Fe è stato precedentemente dimostrato in pazienti con SM .
Abbiamo precedentemente studiato il caso di un giovane uomo affetto da SM, che è stato trattato senza successo per alcuni anni con le terapie attuali . I sintomi rivelati dal paziente erano la perdita subacuta della vista, diplopia e dolore con i movimenti degli occhi come i primi sintomi della neurite ottica; disturbi della motricità fine; parestesia e atassia dell’andatura; disfunzione della vescica e stanchezza significativa. Abbiamo esaminato i suoi livelli di metalli tossici nelle urine, dopo la “sfida” endovenosa con EDTA. Il paziente ha mostrato livelli elevati di Al, Pb e Hg nelle urine. Infatti, è stato sottoposto a un trattamento con EDTA due volte al mese. Sotto trattamento, il paziente ha rivelato nel tempo sintomi migliorati suggestivi della remissione della SM. Infatti, ha recuperato la visione degli occhi e la funzione della vescica e la parestesia è scomparsa così come la stanchezza. Poiché il metallo tossico più rappresentato in questo paziente era Al, abbiamo deciso di esaminare la possibile relazione di intossicazione Al con ND.
I nostri risultati mostrano che i livelli di Al misurati in campioni di urina di pazienti affetti da entrambi MS studiato separatamente e ND totale studiato erano significativamente più alto di quello dei pazienti sani, come riportato nella Figura 2. I pazienti sani visualizzati circa 80 μg/g creatinina, come livelli medi di Al, anche se i valori normali sono 35 μg/g creatinina. Questi dati suggeriscono che l’intossicazione da Al non è necessariamente legato alla comparsa di sintomi clinici ND. Inoltre, i pazienti di controllo sono forse in grado di limitare ulteriore carico Al attraverso meccanismi neuroprotettivi o antiossidanti che sono assenti nei pazienti ND. Valutazioni cliniche di ogni paziente ha suggerito la presenza di una relazione importante tra intossicazione Al e compromissione dei movimenti, parestesia, atassia, e altri sintomi visualizzati da soggetti affetti da ND. Infatti, i pazienti che hanno visualizzato valori massimi di Al nel campione di urina visualizzato anche le caratteristiche più gravi della malattia a livello clinico. L’obiezione che mobilizzando (da agenti chelanti) Al da siti relativamente sicuri come l’osso e depositando questo metallo altamente neurotossico nel SNC può essere pericoloso è opposta dalla considerazione che i pazienti affetti da ND erano affetti da carico Al (responsabile della patogenesi della malattia) nel SNC prima della chelazione. Inoltre, i complessi formati da metallo tossico con agenti chelanti sono ben rimossi dai reni. Studi recenti hanno dimostrato che gravi deficit motori comportamentali e la perdita dei neuroni motori attraverso il sistema nervoso sono risultati quando un adiuvante del vaccino Al è stato applicato ad un modello animale. Infatti, i topi iniettati con idrossido di Al hanno mostrato un aumento significativo della morte cellulare nel midollo spinale e nella corteccia motoria, colpendo principalmente i neuroni motori e inducendo la neuroinfiammazione. Gli effetti assomigliavano molto al danno visto nella SLA umana.
Come recentemente riportato, il sistema immunitario sembra anche essere sensibile all’esposizione ad Al. Gli effetti di Al su autoimmunità, tolleranza orale, espressione CD4 + e CD8 +, ipersensibilità e funzione immunitaria eritrocitaria sono suggestivi della sua attività immunotossicologica. È stato suggerito che molte delle caratteristiche della neurotossicità indotta da Al possono derivare in parte da reazioni autoimmuni.
Infine, in un recente rapporto di Exley C Al è considerato un potenziale contributore all’insorgenza, progressione e aggressività della ND, anche se sembra essere difficile stabilire quando contribuisce all’eziologia della malattia. Tuttavia, poiché Al rappresenta un rischio per la salute umana, è necessario attuare misure per ridurre il suo carico corporeo al più basso limite pratico.
Quale strategia per la terapia comune di lesioni provocate da metalli tossici può essere proposto? L’assorbimento intracellulare di metalli tossici sarebbe adeguatamente impedito da inibitori pertinenti (chelanti), mentre la generazione di ROS e processi mediati da ROS sarebbe impedito o migliorato da antiossidanti pertinenti e spazzini di radicali liberi e Fe.
Nella nostra esperienza, come dimostrato in studi precedenti e nel presente, la rimozione di metalli tossici ha indotto effetti benefici, migliorando i sintomi del paziente. Non sono stati osservati effetti avversi dai trattamenti con EDTA. La rimozione dei metalli è apparsa graduale nel tempo, e ha suggerito molte terapie di chelazione. In conclusione, nel presente studio dimostriamo che la terapia chelante EDTA è stata in grado di ridurre il carico di Al nei pazienti affetti da ND migliorando le loro condizioni cliniche. Speriamo che in futuro tale trattamento sarà considerato come uno strumento utile per migliorare i sintomi dei pazienti affetti da ND.
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi per quanto riguarda la pubblicazione di questo articolo.