Il fungicida azoxystrobin promuove la dominanza dei cianobatteri d’acqua dolce attraverso l’alterazione della competizione

Tossicità di AZ su alghe verdi e cianobatteri

Il cianobatterio modello M. aeruginosa e un’alga verde comune C. pyrenoidosa sono stati utilizzati per studiare la tossicità di AZ su alghe verdi e cianobatteri. La crescita di M. aeruginosa non è stata soppressa dalla gamma di concentrazioni di AZ durante il trattamento di 7 giorni (Fig. 1a), mentre la crescita di C. pyrenoidosa è stata inibita di circa 9,2-30% alle tre concentrazioni di AZ testate dopo 7 giorni (Fig. 1a). La crescita di C. pyrenoidosa in presenza di una bassa concentrazione di AZ (5-10 μg L-1) e a bassa densità iniziale delle cellule algali (circa 20.000 cellule/mL, vicino alla densità algale in natura), che sono condizioni rappresentative di ambienti naturalmente contaminati, è stata inibita significativamente dal 20 ~ 30% (Additional file 1: Figura S2) (p < 0,05), mentre la crescita di M. aeruginosa è rimasta inalterata alle stesse concentrazioni AZ testate. Precedenti studi di laboratorio hanno anche dimostrato che gli effetti tossici inibitori di AZ variavano drasticamente tra alghe verdi e cianobatteri; per esempio, la tossicità di AZ disciolta sulla crescita del clorofito Pseudokirchneriella subcapitata era quasi 500 volte superiore a quella riportata nel cianobatterio Anabaena flos-aquae.

I microcosmi sono stati utilizzati per studiare gli effetti di AZ sulla comunità del plancton. I microrganismi sono stati separati dall’acqua naturale del lago mediante filtrazione e trasferiti in un mezzo artificiale, dopodiché una serie di concentrazioni di AZ è stata aggiunta ai microcosmi. Le concentrazioni di Chl-a e ficocianina sono state misurate nei microcosmi dopo il trattamento con AZ. La concentrazione di Chl-a, che stima la biomassa totale del fitoplancton, ha raggiunto 4 mg L-1 nei microcosmi di controllo dopo 3 giorni di coltura nel mezzo e si è verificata una fioritura di fitoplancton (Fig. 1b). L’esposizione a una concentrazione di AZ superiore o uguale alla concentrazione più bassa testata (0,5 mg L-1) per 3 giorni ha diminuito la concentrazione di Chl-a, indicando che AZ può avere effetti tossici sulle popolazioni di fitoplancton che comprendono le alghe verdi (Fig. 1b). La concentrazione di Chl-a è diminuita dall’8,7% al 37,3% nella gamma di concentrazioni di AZ testate nei microcosmi. Al contrario, la produzione di un altro pigmento, la ficocianina, che è stata utilizzata come proxy per la biomassa cianobatterica, è aumentata dopo l’esposizione di 3 giorni a concentrazioni di AZ superiori o uguali a 2,5 mg L-1 (Fig. 1c), suggerendo che AZ ha favorito la crescita cianobatterica nel microcosmo.

Il tasso di decomposizione di azoxystrobin nell’ambiente acquatico è stimolato dalla luce e AZ ha una fotolisi acquosa DT50 (tempo di dissipazione del 50%) (pH 7) tra 8,7 e 13,9 giorni . È interessante notare che le concentrazioni disciolte di AZ sono diminuite in modo diverso nel tempo in risposta alle alghe verdi e ai cianobatteri; diminuendo più rapidamente in C. pyrenoidosa che nelle colture di M. aeruginosa (Fig. 1d). Questo indica che l’alga eucariotica C. pyrenoidosa ha assorbito più AZ disciolto rispetto a M. aeruginosa, anche se sono stati inoculati alla stessa densità ottica. L’esaurimento della concentrazione di AZ disciolta nei microcosmi è stato anche più rapido che nelle colture di M. aeruginosa (Fig. 1d). L’esaurimento di AZ nei microcosmi potrebbe essere spiegato dall’assorbimento/adsorbimento preferenziale di AZ nell’alga verde (il componente principale nei microcosmi) così come un maggiore assorbimento di AZ su altri microrganismi acquatici tranne i cianobatteri. I risultati di cui sopra suggeriscono che C. pyrenoidosa era molto più sensibile all’AZ rispetto a M. aeruginosa, probabilmente a causa di un maggiore consumo di AZ (assorbimento/adsorbimento) in C. pyrenoidosa.

Variazione delle proporzioni di trascrizione dopo l’esposizione AZ nell’intera comunità di plancton

Il sequenziamento metatrascrittomico è stato effettuato per studiare i cambiamenti nella trascrizione dell’intera comunità di plancton dopo l’esposizione AZ. Un riassunto dei risultati del sequenziamento meta-trascrittomico è fornito nel file aggiuntivo 1: Risultati estesi. Proporzioni tassonomiche di trascrizioni in due gruppi a diversi livelli tassonomici sono mostrati nel file aggiuntivo 2: Dataset 2, che sono stati rappresentati dall’abbondanza relativa di trascrizioni tassonomicamente annotati (RAT). Il valore RAT non rappresenta la biomassa microbica, ma piuttosto i cambiamenti nell’attività trascrizionale tra le specie, che rappresenta gli stati metabolici attivi e le funzioni della comunità microbica.

L’abbondanza relativa di RAT nei microcosmi di controllo dopo 7 giorni di cultura era principalmente controllata da Monoraphidium sp. (un genere Chlorophyta) (Fig. 2). Tuttavia, l’abbondanza relativa di RAT di Chlorophyta è diminuita dal 63,6% nel controllo al 35,8% nei microcosmi trattati con AZ (Fig. 2a, Additional file 1: Tabella S2) anche se il conteggio tassonomico dei trascritti delle classi principali all’interno del phylum Chlorophyta non è stato influenzato molto dal trattamento AZ (Fig. 2c). L’abbondanza relativa di RAT di altre specie algali eucariotiche tra le Phaeophyceae e Eustigmatophyceae è anche diminuita significativamente nei microcosmi trattati con AZ (p < 0,05), mentre l’abbondanza di Bacillariophyta è aumentata di ~ 6 volte (file aggiuntivo 1: Tabella S2). Nel frattempo, il RAT di Cyanobacteria (principalmente composto da Synechococcales) è aumentato drammaticamente di più di 20 volte, cioè, da 1,7% nel gruppo di controllo a 38,3% nel gruppo AZ. Il rapporto di abbondanza della sequenza eucariota/prokaryota è diminuito da 3,1 a 0,9 (Fig. 2b) nei microcosmi trattati con AZ principalmente a causa del drastico aumento dei Cyanobacteria e la diminuzione dei Chlorophyta, rispettivamente. L’aumento dei cianobatteri nei microcosmi trattati con AZ era accoppiato a una maggiore proporzione di Synechococcales e una minore proporzione di Chroococcales (Fig. 2d), mentre AZ non ha influenzato l’abbondanza relativa degli ordini all’interno dei Chlorophyta, la principale divisione eucariotica (Fig. 2c). I cianobatteri all’interno dell’ordine Synechococcale possono formare fioriture tossiche, potenzialmente influenzando i concorrenti algali eucarioti. a Numero atteso di frammenti per chilobase di sequenza di trascrizione per milioni di paia di basi sequenziate (FPKM) dei sei microcosmi calcolato dall’analisi meta-trascrittomica che indica i principali gruppi tassonomici (livello di phylum) nei microcosmi senza aggiunta di azoxystrobin (gruppo di controllo) e nei microcosmi con 2,5 mg L-1 (gruppo AZ) per 7 giorni. b Proporzioni tassonomiche di trascrizioni in diversi regni nel gruppo di controllo o AZ. Proporzioni tassonomiche di trascrizioni di diversi ordini all’interno della divisione dei Chlorophyta (c) e dei Cyanobacteria (d) nel controllo o nel gruppo AZ

AZ inibisce sia Monoraphidium sp. che Synechococcus sp. in monocolture

Come il RAT di Monoraphidium sp. era dimezzato e il RAT di Synechococcus sp. nettamente aumentata dopo il trattamento con AZ, sono stati eseguiti biotest di tossicità AZ in colture di laboratorio di Synechococcus sp. e Monoraphidium sp. per rafforzare la nostra ipotesi che l’aggiunta di AZ nei microcosmi potrebbe favorire preferenzialmente un cianobatterio (Synechococcus sp.) rispetto a un concorrente algale verde (Monoraphidium sp.). È interessante notare che la crescita di monocolture di Synechococcus sp. in BG-11 medium come inibita di ~ 28% dopo 7 giorni (Fig. 3a) (p < 0,05) ad una concentrazione iniziale di AZ di 2,5 mg L-1, anche se non era significativamente influenzata dopo 4 giorni di esposizione (p = 0,21), indicando che la crescita di Synechococcus sp. potrebbe essere inibita da una lunga esposizione ad alte concentrazioni AZ. Al contrario, la crescita di Monoraphidium nelle colture monoalgali di laboratorio è stata sempre inibita durante l’intero processo di coltivazione; con una resa cellulare inibita di ~ 45% dopo 7 giorni di esposizione a 2,5 mg L-1 AZ (concentrazione iniziale) (Fig. 3b). I risultati di cui sopra indicano che Monoraphidium sp. è più sensibile a AZ rispetto a Synechococcus sp. A causa del notevole vantaggio di crescita di Synechococcus sp. nei microcosmi trattati con AZ (Fig. 2d), sembra che AZ giochi un ruolo indiretto nel beneficiare Synechococcus sp.

AZ inibisce Monoraphidium sp. e beneficia Synechococcus sp. in co-culture

Nella co-cultura delle due specie di alghe, è stato trovato che l’aggiunta di AZ beneficia Synechococcus sp. rispetto a Monoraphidium sp. sia in acqua di lago eutrofica filtrata (Fig. 3c-f) che in mezzo BG-11 modificato (Additional file 1: Figura S3), che era in accordo con i risultati RAT dell’analisi meta-transcriptomica. Dopo una cultura di 7 giorni in acqua di lago eutrofica, il rapporto numero di cellule (Synechococcus/Monoraphidium) è stato migliorato dal trattamento AZ, da 1.2 nel controllo a 2.3, 3.6, o 7.7, per il trattamento con 25 μg L-1, 250 μg L-1, o 2.5 mg L-1 AZ, rispettivamente (Fig. 3c-f). I risultati della crescita algale procariotica ed eucariotica nel mezzo BG-11 modificato (Additional file 1: Figura S3) erano simili a quelli dell’acqua eutrofica del lago, dove il Synechococcus sp. guadagna la dominanza nel trattamento AZ. Esiste un equilibrio tra alghe verdi e cianobatteri in acqua naturale, guidato da diversi fattori tra cui interazioni allelopatiche e feedback positivo. La presenza di AZ disturbato questo equilibrio, probabilmente attraverso l’alterazione del metabolismo delle alghe verdi, e stimolato Synechococcus sp. crescita rispetto a quella di Monoraphidium sp. nelle co-culture (Fig. 3c-f). Dopo il trattamento AZ, il numero di cellule di Synechococcus sp. è aumentato a ~ 1,5 volte in co-cultura (Fig. 3c-f), mentre il RAT di Synechococcus sp. è aumentato più di 20 volte nel microcosmo rispetto al controllo. Poiché il RAT non può essere facilmente paragonato alla densità cellulare, è difficile confrontare quantitativamente gli esperimenti di laboratorio e di microcosmo. Tuttavia, entrambi gli esperimenti suggeriscono che AZ favorisce la crescita dei cianobatteri modificando la competizione con le alghe verdi.

AZ cambia l’attività trascrizionale di funghi, virus, batteri e zooplancton

Il RAT dei funghi, compresi Zygomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Ascomycota, sono tutti diminuiti significativamente (p < 0.05) dopo l’esposizione ad AZ rispetto al controllo (Additional file 1: Tabella S2) a causa dell’azione fungicida di AZ. Vale la pena notare che il RAT del phylum Chlorobi, che include batteri fotosintetici che non producono ossigeno e preferiscono ambienti anaerobici, è anche aumentato significativamente (~ 8 volte) (p < 0,05) nei microcosmi trattati con AZ. Anche se la concentrazione totale di ossigeno disciolto (DO) è rimasta supersatura nei microcosmi trattati con AZ rispetto al controllo (Additional file 1: Figura S4), le microzone anossiche che circondano gli aggregati microbici (forse cianobatterici) possono essere ben sviluppate nei microcosmi trattati con AZ, il che sarebbe in linea con l’aumento del RAT di Chlorobi. Il RAT dello zooplancton nella maggior parte dei phylum, come Arthropoda, Nematoda e Cnidaria, è diminuito sotto l’esposizione AZ rispetto al controllo (Additional file 1: Tabella S2), mentre il contrario è stato vero per alcuni generi come Acanthamoeba (Tabella 1). In generale, il RAT di alcuni zooplancton (come Daphnia, da Arthropoda), funghi (appartenenti a Chytridiomycota), batteri eterotrofi (Cytophaga e Bdellovibrio), e virus (Podoviridae, Siphoviridae, e Myoviridae) è significativamente diminuito (p < 0,05) nei microcosmi trattati con AZ rispetto a quello nel controllo (Tabella 1, Fig. 4). Gli organismi planctonici di cui sopra possono brucare, parassitare o lisciviare i cianobatteri e giocare un ruolo nel controllo della loro abbondanza e quindi potrebbe spiegare in parte la dominanza dei cianobatteri in presenza di AZ. Un’altra possibilità per la diminuzione dell’abbondanza relativa dello zooplancton è che questi cambiamenti possono riflettere la diminuzione dei clorofiti commestibili e l’aumento dei cianobatteri non commestibili, perché i clorofiti hanno una maggiore sensibilità all’AZ rispetto ai cianobatteri.

È anche noto che le zoospore fungine giocano ruoli critici nel collegamento tra cianobatteri non commestibili e zooplancton. Gli artropodi (cladoceri o copepodi) non sono in grado di sintetizzare steroli de novo e devono trovarli dal loro cibo. Per esempio, le zoospore del chytrid sono un complemento alimentare essenziale per le Daphnia quando pascolano sui cianobatteri filamentosi. Poiché il fungicida AZ ha fortemente inibito i funghi e quindi ha probabilmente ridotto le zoospore fungine (Tabella 1), è possibile che il pascolo delle Daphnia sui cianobatteri diminuisca, il che a sua volta contribuirebbe a diminuire la crescita delle Daphnia (Tabella 1) e ad aumentare la crescita dei cianobatteri, proteggendo così i cianobatteri dal pascolo. Né la comunità di zooplancton né i virus e i parassiti dei cianobatteri erano in grado di controllare la fioritura cianobatterica. Tuttavia, essi possono aggiungere stabilità al sistema acquatico modificando la struttura della rete alimentare e possono influenzare la comunità microbica e contribuire potenzialmente alla fioritura cianobatterica.

Processi metabolici in eucarioti e batteri in risposta al trattamento AZ

Siccome le informazioni di annotazione trascrittomica globale sono limitate nel genere Chlorella e altri clorofiti, le analisi meta-trascrittomiche dell’intera comunità microbica sono state utili per comprendere ulteriormente le interazioni tra organismi planctonici e cianobatteri. Un riassunto dell’annotazione funzionale è fornito nel file aggiuntivo 1: Risultati estesi, e la variazione funzionale dettagliata è fornita nel file aggiuntivo 2: Dataset 3, 4. Abbiamo distinto le sequenze di eucarioti e batteri e le abbiamo sezionate al livello 3 di KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). La figura 5 mostra i 40 percorsi più importanti basati sull’abbondanza relativa dei trascritti (appartenenti a quattro sistemi metabolici menzionati nella sezione precedente) in eucarioti e batteri.

Anche se la proporzione di eucarioti che li compone non è stata pesantemente influenzata da AZ (file aggiuntivo 1: Figura S5a), i percorsi KEGG livello 3 sono stati spesso sensibilmente influenzati (file aggiuntivo 2: Dataset 4). Come mostrato in Fig. 5a, i percorsi più altamente sovraespressi a causa della presenza di AZ nell’eucariota erano la trasduzione del segnale ormonale delle piante, la via di segnalazione MAPK, il metabolismo dell’azoto, la proteolisi mediata dall’ubiquitina e il metabolismo dei glicerofosfolipidi, e i percorsi più sottoespressi erano il metabolismo della porfirina e della clorofilla, la fosforilazione ossidativa e il perossisoma, indicando che AZ modula l’espressione genica funzionale in eucariota.

In risposta alla fioritura cianobatterica, la struttura della comunità batterica e l’abbondanza relativa delle vie metaboliche è cambiata drasticamente (Fig. 5b e file aggiuntivo 1: Figura S5b). Come mostrato in Fig. 5b, i percorsi strettamente legati ai cianobatteri sono stati significativamente sovraespressi (p < 0,05), tra cui la biosintesi dei carotenoidi (+ 1326% rispetto al controllo), le proteine della fotosintesi-antenna (+ 1305%) e la fotosintesi (+ 758%). Abbiamo anche notato che molti percorsi con una bassa abbondanza relativa (< 0,05) legati all’antibiosi, al metabolismo delle vitamine e alla sintesi dei polisaccaridi erano differenzialmente espressi in risposta a AZ (Additional file 2: Dataset 4). Queste funzioni sono discusse di seguito.

1. Modulazione della fosforilazione ossidativa e della fotosintesi da AZ. Il livello di espressione relativa dei geni legati alla fosforilazione ossidativa sia negli eucarioti che nei procarioti è diminuito drammaticamente nei microcosmi trattati con AZ, e il grado di inibizione nei due regni era equivalente, cioè ~ 42% rispetto al controllo. I geni (atpA, atpB, atpD e atpF) che codificano per l’enzima F-ATPasi, nelle membrane mitocondriali e cloroplastiche, erano significativamente sottoespressi sia negli eucarioti che nei batteri (diminuiti di circa il 40~80%) (p < 0,05). Questa diminuzione della trascrizione della F-ATPasi potrebbe essere spiegata dall’azione tossica di AZ, che inibisce il complesso di trasferimento degli elettroni tra il citocromo b e il citocromo c1, diminuendo la respirazione mitocondriale e la produzione di ATP. Per quanto riguarda le vie metaboliche fotosintetiche, la modulazione dei trascritti del fotosistema dopo il trattamento AZ è stata diversa tra eucarioti e batteri (Additional file 1: Figura S6). Nei batteri, i geni coinvolti nel ficobilisoma (ad esempio, apcD, apcE, cpeC, cpeZ) sono stati fortemente sovraespressi (da circa 4-32 volte), mentre in eucariota, la trascrizione dei geni che codificano per le proteine del complesso di raccolta della luce (ad esempio, LHCB2 e LHCA1) è rimasto per lo più invariato (Additional file 2: Dataset 5). Questo è in linea con l’aumento dei cianobatteri nei microcosmi trattati con AZ. Vale la pena notare, tuttavia, che i batteri possono avere meccanismi di detossificazione AZ per diminuire la tossicità AZ da un forte aumento (da circa 10-24 volte) di NAD (P) H-quinone ossidoreduttasi geni (ndhD, ndhF, ndhH), che codificano un enzima proteggere le cellule contro lo stress ambientale che può verificarsi in presenza di AZ. Inoltre, i procarioti possono disintossicare le specie reattive dell’ossigeno attraverso un aumento della biosintesi dei carotenoidi (+ 1326%) e del metabolismo del glutatione (+ 344%) e migliorare la riparazione cellulare (geni coinvolti nel mismatch repair, + 211%).

2. Sintesi e degradazione dei polisaccaridi. La trascrizione di diversi geni legati alla biosintesi dei polisaccaridi negli eucarioti è aumentata (Additional file 1: Table S3), per esempio, i geni nelle vie di biosintesi dei lipopolisaccaridi (+353%). Un sistema associato ai polisaccaridi (trasportatore ABC, +162%) è stato anche sovraespresso sia nel gruppo AZ che in quello di controllo, che ha dimostrato di esportare i polisaccaridi al di fuori delle cellule. Una maggiore sintesi di polisaccaridi nel fitoplancton è stata riportata in ambienti stressanti. Al contrario, nei batteri, 4 percorsi (biosintesi dei glicani N, vari tipi di biosintesi dei glicani N, biosintesi dei lipopolisaccaridi e biosintesi dei peptidoglicani) relativi alla sintesi dei glicani erano sottoespressi (di circa il 63~77%) in modo significativo (p < 0,05), ma il percorso “altra degradazione dei glicani” era sovraespresso di ~ 10 volte nei microcosmi trattati con AZ rispetto al controllo. Supponendo che la diminuzione generalizzata prevista nella sintesi dei polisaccaridi nei procarioti si sia verificata nei cianobatteri, una diminuzione putativa della zavorra di polisaccaridi nei cianobatteri potrebbe aiutare a mantenere i cianobatteri alla superficie del lago e a sfruttare la luce, che è fortemente attenuata con la profondità durante la fioritura. Diversi cianobatteri, compresi quelli del genere Synecocchococus, hanno infatti dimostrato di modulare la galleggiabilità attraverso la sintesi di polisaccaridi.

3. Modulazione della biosintesi delle vitamine e potenziali interazioni tra batteri ed eucarioti. Negli eucarioti, tutti i percorsi relativi alla biosintesi delle vitamine B (ad esempio, tiamina, riboflavina, niacinamide, pantotenato, vitamina B6, biotina, acido lipoico e folato) sono stati sovraespressi (da 14 ~ 243%) nei microcosmi trattati con AZ rispetto al controllo (Additional file 1: Tabella S4). Al contrario, nei batteri, le vie biochimiche relative alla biosintesi di folato, nicotinamide e tiamina sono state sovraespresse (37~139%) dopo l’esposizione AZ nei microcosmi, mentre le vie biosintetiche delle vitamine in minore abbondanza relativa (cioè, biotina e acido lipoico, riboflavina, B6) sono stati significativamente sotto-espressi (da 22 ~ 68%, p < 0.05) nel AZ trattati microcosmi rispetto al controllo (Additional file 1: Tabella S4). È interessante notare che nei batteri, l’abbondanza relativa di due geni coinvolti nel trasporto della vitamina B12 (cobalamina) (cioè, btuB o K16092: trasportatore della vitamina B12 e btuF o K06858: proteina legante il substrato del sistema di trasporto della vitamina B12) è diminuita del 88% e del 57%, rispettivamente, nei microcosmi trattati con AZ rispetto al controllo (vedi file aggiuntivo 2: Dataset 5). Dal momento che diverse specie eucariotiche (compresi i funghi e molte clorofite) non possono sintetizzare cobalamina de novo e si basano su batteri mutualistici per acquisire questa vitamina, i nostri risultati supportano l’ipotesi che l’aumento di cianobatteri in presenza di AZ può essere, almeno in parte, spiegato da una diminuzione della vitamina B12 scambio mutualistico tra batteri ed eucarioti.

AZ ha cambiato le interazioni tra funghi, alghe eucariotiche e cianobatteri

I nostri risultati sono coerenti con le interazioni allelopatiche tra funghi o eucarioti e procarioti con potenziali implicazioni nella dinamica della fioritura cianobatterica. In primo luogo, la nostra segnalata diminuzione dell’attività relativa di molti funghi, che produce diversi metaboliti secondari che promuovono la lisi cellulare dei cianobatteri, può contribuire a favorire i cianobatteri. In secondo luogo, due vie eucariotiche di biosintesi degli antibiotici (biosintesi dei monobatteri (+ 1524%) e biosintesi di penicillina e cefalosporina (+ 161%), sono state espresse preferenzialmente da 1,6 a 15 volte sotto l’esposizione AZ. Questo suggerisce che i microrganismi eucarioti potrebbero rispondere all’aumento dei cianobatteri con la produzione di composti antibatterici, anche se è improbabile che questo impedisca i focolai di fioritura cianobatterica. In terzo luogo, come mostrato nel file aggiuntivo 1: Figura S7, l’abbondanza relativa di cianobatteri nella comunità batterica era 39.3% nel nostro sito di campionamento dal lago Taihu (derivante da dati di sequenziamento del gene 16S rRNA), mentre il RAT di cianobatteri nei batteri dopo 7d-cultura nei gruppi di controllo e AZ-trattati erano 7.1% e 72.1%, rispettivamente. Ha indicato che la grande proporzione di alghe verdi (Fig. 3c) potrebbe limitare l’attività dei cianobatteri, anche in condizioni eutrofiche.

Potenziale impatto a lungo termine della contaminazione AZ a breve termine

Come mostrato nel file aggiuntivo 1: Figura S8, dopo 50 giorni di coltivazione, le alghe e la materia organica si sono depositate nei microcosmi, rendendoli chiari nel gruppo di controllo. Tuttavia, il gruppo AZ mostrava ancora le caratteristiche tipiche di una fioritura algale, apparendo verde e torbido. Questo interessante fenomeno ha illustrato che, sebbene la concentrazione di AZ fosse al di sotto dei limiti di rilevamento dopo 15 giorni nei microcosmi (Fig. 1d), l’alta variabilità nella fase primaria causa ancora un’influenza duratura fino a 50 giorni (Additional file 1: Figura S8). Il residuo di AZ è stato ampiamente rilevato nell’ambiente acquatico, indicando che questi corpi idrici possono aver sofferto una volta in una contaminazione a breve termine ad alta concentrazione di AZ. L’AZ disciolto è diminuito rapidamente nei microcosmi (Fig. 1d), scendendo al di sotto del limite di rilevamento dopo 15 giorni di coltura algale, il che indica che AZ disciolto è stato dissipato rapidamente nei microcosmi. Nei sistemi idrici naturali, AZ può essere assorbito dal plancton, adsorbito su superfici organiche e sedimenti, o essere dissipato attraverso la biodegradazione e la fotolisi. Pertanto, la concentrazione di picco AZ dovrebbe essere molto superiore alle concentrazioni disciolte rilevate in laghi, corsi d’acqua o acque sotterranee da 0,01 a 29,70 μg L-1 , suggerendo che le concentrazioni di fungicidi vicino a quelli utilizzati nei nostri esperimenti può ben verificarsi transitoriamente che causerebbe effetti negativi a lungo termine. Per esempio, i residui del fungicida Thiram® potrebbero essere rilevati nell’intervallo di 0.27-2.52 mg L-1 dall’acqua superficiale intorno alle trame applicate. Inoltre, vari altri fungicidi che possono interagire con AZ esistono nei sistemi acquatici (spesso adsorbiti ai sedimenti) e possono essere rilasciati nuovamente nelle acque di superficie attraverso la rimobilizzazione dei sedimenti. Ne consegue che elevate concentrazioni di AZ negli ambienti (almeno sporadicamente) potrebbero indurre effetti tossici sui microrganismi acquatici, mentre paradossalmente, favorire la crescita cianobatterica.

La contaminazione da fungicidi coesiste sempre con sovra-arricchimento di nutrienti nei corpi idrici vicino alle regioni agricole, dove spesso si verificano fioriture cianobatteriche. Possiamo presumere che l’eutrofizzazione e il contaminante AZ si verifichino simultaneamente in un’area d’acqua limitata vicino ai campi coltivati dopo le piogge, il che causerebbe cambiamenti drammatici della struttura della comunità microbica e promuoverebbe le fioriture cianobatteriche. Questi cianobatteri potrebbero essere trasferiti ad altri corpi idrici dopo la prossima pioggia. Cambieranno quindi la struttura della comunità delle acque contaminate e contribuiranno all’eutrofizzazione delle acque vicine. È noto che la rete ecologica microbica ha un proprio equilibrio, che potrebbe essere alterato dall’eutrofizzazione. Questo studio indica che i fungicidi possono giocare un ruolo importante nella promozione degli HCB attraverso complesse interazioni della rete comunitaria.