Rassegna storica
I risultati delle anomalie assonali indotte dal trauma nella maggior parte dei modelli sperimentali di trauma cranico, senza rottura della mielina o danno franco ai processi neurali o gliali adiacenti, non hanno fornito prove della lacerazione diretta degli assoni dopo un trauma.910 Questo è stato supportato da studi di frattura da congelamento, condotti nelle prime fasi della lesione assonale, che non sono riusciti a mostrare né la rottura immediata della mielina internodale né la perdita precoce delle giunzioni gliali-assonali, suggerendo che la stessa guaina mielinica non è immediatamente danneggiata dalle forze della lesione.23 A questo punto entrambi i gruppi di cui sopra hanno postulato che le forze della lesione traumatica agiscono prima sull’assolemma o sull’assoplasma, risparmiando la guaina mielinica. Nell’ambito di questa ipotesi, le forze meccaniche della lesione potrebbero allungare o ferire l’assolemma fino ai suoi limiti biomeccanici, a quel punto l’omeostasi ionica verrebbe meno e inizierebbe il cambiamento assonale reattivo.
Tuttavia, in una serie di indagini successive su tessuto cerebrale umano1222 e animale2124 , Povlishock e colleghi hanno fornito dati a sostegno di un ruolo iniziale del citoscheletro intra-assonale. I loro studi hanno rivelato una complessa sequenza di eventi intra-assonali che progrediscono fino al cambiamento assonale reattivo. In particolare, usando anticorpi diretti alla componente del neurofilamento del citoscheletro, hanno scoperto che c’era un accumulo focale della subunità 68 kDa (NF-L) entro un’ora dalla lesione e questo aumento era drammatico entro due ore. Con l’aumentare del tempo i neurofilamenti sono diventati disorganizzati e disallineati rispetto all’asse longitudinale dell’assone. Non c’era nessuna perdita o dissoluzione di neurofilamenti rilevato. Questi dati erano quindi incoerenti con la degradazione mediata da una proteasi neutra del citoscheletro. Invece, l’aumento della subunità 68kDa del neurofilamento ha sostenuto la possibilità di un riarrangiamento traumaticamente indotto del pool di neurofilamenti. Inoltre, in questa serie di esperimenti non è stata rilevata alcuna prova ultrastrutturale di interruzione axolemmale diretta. Il ripiegamento e la distensione dell’assolemma sono stati trovati e attribuiti al cambiamento assonale reattivo in corso. Questi risultati hanno suggerito che un effetto meccanico diretto sul citoscheletro del cilindro assonico era l’evento cardine nella patogenesi iniziale della lesione assonale.
Altri approcci hanno suggerito che l’assolemma fosse coinvolto nell’inizio del cambiamento assonale reattivo. Maxwell et al hanno usato un modello di trazione nervosa per analizzare i cambiamenti morfologici all’interno degli assoni danneggiati.18 Questi autori hanno fornito la prova che i siti iniziali di danno, dopo una lesione da stiramento non distruttiva, sono i nodi di Ranvier, alcuni dei quali sviluppano “blebs nodali”. Questi blebs sono protrusioni limitate dell’assolemma nello spazio perinodale e sono più numerosi entro 15 minuti dalla lesione, ma meno a intervalli successivi. Lo sviluppo dei blebs nodali è correlato alla perdita del denso rivestimento dell’assolemma. Negli assoni danneggiati con bolle nodali i neurofilamenti erano disorganizzati, deviati dall’asse longitudinale dell’assone ed estesi nelle bolle. Al contrario, i microtubuli hanno mantenuto la loro disposizione longitudinale e non hanno deviato nel bleb. L’analisi quantitativa di questo materiale ha mostrato che c’era una perdita significativa di microtubuli e un aumento della spaziatura dei neurofilamenti nell’assoplasma dei nodi con associati blebs nodali. Questa perdita di microtubuli potrebbe interrompere il trasporto assoplasmatico veloce con conseguente accumulo focale di organelli membranosi nelle regioni paranodali adiacenti dell’assone per formare rigonfiamenti assonali. Inoltre, questi lavoratori hanno fornito la prima prova citochimica a sostegno dell’idea dell’afflusso di calcio nelle fibre nervose mieliniche ferite dallo stiramento.25 L’uso della tecnica dell’ossalato-piroantimonato per la localizzazione del calcio ha mostrato un aumento del contenuto di precipitato piroantimonato all’interno delle macchie nodali a 15 minuti dalla lesione da stiramento. Ciò era correlato a una riduzione dell’etichettatura per l’attività della pompa di membrana Ca2+ATPasi sull’assolemma nodale.26 Il nodo di Ranvier è la regione specializzata dell’assolemma in cui sono localizzati gruppi di canali Na+, pompe ATPasi per il calcio e uno scambiatore Na+/Ca2+.2027 Pertanto, la perdita dell’attività della pompa di membrana nell’assolemma nodale potrebbe fornire un meccanismo di afflusso di calcio libero nei nodi di Ranvier dopo una lesione traumatica. Questa evidenza supporta l’ipotesi che le forze della lesione traumatica provochino una pertubazione focale dell’assolemma con il conseguente afflusso di calcio libero in grado di attivare una sottopopolazione di proteasi neutre.25
Indagini biofisiche hanno utilizzato nuove tecniche per analizzare l’assolemma in condizioni sperimentali simili alla lesione assonale. Dopo una lieve lesione da stiramento, una serie di costrizioni ed espansioni si verifica nelle fibre del nervo sciatico del ratto adulto. Questo cambiamento di forma è noto come beading.28-30 La trasformazione della forma essenzialmente cilindrica della fibra nervosa normale in una che è beaded si verifica rapidamente, entro 10 a 20 secondi sull’inizio del tratto. I dati sperimentali iniziali hanno suggerito che il beading sia causato da un meccanismo legato all’assolemma, o al citoscheletro, o a entrambi. In questo modello, la proteina transmembrana β1-integrina si lega sia alla matrice extracellulare che al citoscheletro.14 La tensione esercitata sulla matrice extracellulare viene segnalata attraverso la β1-integrina al citoscheletro con conseguente alterazione della sua integrità e disposizione spaziale. Tuttavia, uno studio recente ha indicato che il beading non richiede un citoscheletro interconnesso e ha concluso che l’assolemma è il sito iniziale o il luogo della costrizione del beading.31 È degno di speculazione che il beading possa essere parte del processo biologico che è descritto come cambiamento assonale reattivo nella letteratura relativa alla lesione assonale indotta dal trauma.
Negli ultimi quattro anni è stato stabilito il coinvolgimento dell’assolemma nella patogenesi della lesione assonale. Maxwell et al hanno dimostrato che una grave lesione cerebrale traumatica causata da un’accelerazione laterale era in grado di lacerare direttamente l’assolemma nei primati non umani.32 Questo studio è stato il primo a fornire prove ultrastrutturali a sostegno del concetto di tranciatura assonale nella lesione traumatica al cervello. La perdita di integrità assolemmale era associata a una rapida dissoluzione del citoscheletro assonale. Negli assoni che mostravano la lacerazione o la frammentazione assonale, l’organizzazione filamentosa del citoscheletro era sostituita da un precipitato flocculante coerente con una rapida dissoluzione delle proteine citoscheletriche sottostanti. Questi cambiamenti sono stati rilevati entro pochi minuti dalla lesione, ma si sono verificati solo in una sottopopolazione di assoni di calibro fine e finemente mielinizzati dopo una lesione grave. Questi cambiamenti morfologici rappresentavano una risposta acuta degli assoni alla lesione ed è stata definita “assotomia primaria” – definita come avvenuta entro pochi minuti dalla lesione, in contrasto con l’assotomia secondaria ritardata, che si sviluppa in un periodo di ore. Nello stesso materiale sperimentale non c’era evidenza di rottura dell’assolemma un’ora dopo la lesione. Questo suggerisce che la membrana assonale danneggiata si risigilla entro un’ora dalla lesione.
Dopo questa pubblicazione, Povlishock e colleghi hanno riconsiderato la loro ipotesi centrale, che non includeva un ruolo dell’assolemma nell’inizio della lesione assonale indotta dal trauma. Riflettendo, hanno suggerito che la lacerazione diretta dell’assolemma può rappresentare l’estremità più grave di una gamma di alterazioni assolemmali.33 Questo è stato un punto di svolta importante, in quanto, per molti anni questo gruppo di ricerca aveva sostenuto che non vi era alcuna prova di alterazioni dirette nell’assolemma dopo la lesione in nessuno dei numerosi paradigmi che avevano studiato. Inoltre, avevano sostenuto che la patobiologia della lesione assonale indotta dal trauma derivava dalla compromissione diretta del trasporto assoplasmatico dovuta alle forze della lesione che interrompevano direttamente il citoscheletro assonale.71221
In una serie di esperimenti progettati per indagare questo problema, Povlishock e colleghi hanno impiegato il tracciante extracellulare, la perossidasi di rafano (HRP), per determinare se le alterazioni dirette nell’assolemma fossero rilevabili nelle lesioni cerebrali traumatiche di gravità lieve e moderata.3334 Questo nuovo approccio era basato sul principio che i traccianti macromolecolari come la HRP sono normalmente esclusi dall’assoplasma da un assolemma intatto. Pertanto, il rilevamento dell’attività della perossidasi intra-assonale costituirebbe la prova della rottura dell’assolemma. Inoltre, il sito dell’attività della perossidasi delineerebbe il sito iniziale della pertubazione assonale, permettendo di comprendere i fattori iniziali coinvolti nella patogenesi dell’assotomia secondaria. I loro risultati hanno mostrato che la patobiologia della lesione assonale indotta da traumi era un processo eterogeneo e complesso che coinvolgeva una patologia iniziale multipla e varia.
In particolare la gravità della lesione traumatica determinava gli eventi successivi nell’assolemma e nel citoscheletro con conseguente risposta differenziale all’insulto. In particolare, dopo una lesione moderata, sono state rilevate pertubazioni dirette dell’assolemma che si riflettono nella sua alterata permeabilità alle macromolecole.33-35 Ciò è stato associato a una rapida compattazione locale dei neurofilamenti assonali come evidenziato da una diminuzione della distanza interfilamentare. Tuttavia, dopo una lieve lesione cerebrale traumatica non è stata rilevata alcuna prova di alterazioni nell’assolemma ed è stato trovato un diverso insieme di anomalie citoscheletriche, con disallineamento e gonfiore assonale. Una risposta differenziale alla lesione era stata precedentemente descritta in un modello di carico di compressione della lesione assonale.36 Con basso carico di trazione, gli assoni hanno mostrato interruzione assoplasmatica indipendente da qualsiasi cambiamento nell’integrità assolemma, del tutto coerente con quei cambiamenti descritti con lieve lesione cerebrale traumatica. Con lesioni più gravi, gli stessi assoni rivelato cambiamento axolemmal che correlato con drammatico fallimento axoplasmic. Studi successivi hanno esteso questi risultati dimostrando che queste alterazioni nell’assolemma e nel citoscheletro non sono né modello3435 né specie specifiche.37 Inoltre, dopo la dimostrazione delle alterazioni indotte dal trauma nella permeabilità assolemmale, gli studi hanno suggerito che il calcio può essere coinvolto nell’inizio degli eventi citoscheletrici. Questa apparente contraddizione con i punti di vista precedenti derivava dal fatto che essi postulavano che il calcio agisse attraverso meccanismi precedentemente non identificati. Invece di attivare gli enzimi proteolitici, il calcio potrebbe agire in modo meno drammatico per alterare le braccia laterali dei neurofilamenti, causando il collasso dei neurofilamenti con conseguente aumento della loro densità di impacchettamento. Concepibilmente queste braccia laterali di neurofilamenti potrebbero essere scisse da processi mediati dal calcio o deforilate attraverso l’azione di chinasi e fosfatasi per provocare un’alterazione della spaziatura tridimensionale dei neurofilamenti.1
In conclusione, la controversia sul ruolo dell’assolemma nella patobiologia delle lesioni assonali indotte dal trauma è stata risolta in una certa misura. Ora si concorda sul fatto che la rottura dell’assolemma è l’evento iniziale in alcune forme di lesione traumatica. Tuttavia, la base meccanicistica dell’assotomia secondaria è ora vista come sempre più complessa, con alterazioni del citoscheletro assonale dimostrate nelle forme più gravi di lesione cerebrale traumatica.