クロマチン免疫沈降法（ChIP）の概要

ChIPとは

Chromatin immunoprecipitation, ChIPは、特定のDNA結合タンパク質とそのDNAターゲットを選択的に濃縮するために用いられる抗体ベースの技術である。

ChIPは、ヒストン、ヒストン修飾、転写因子、補因子などのタンパク質を選択的に認識・結合する抗体を用いて、クロマチン状態および遺伝子転写に関する情報を提供します。

ChIPはどのような場合に使用されますか？

通常、ChIPはゲノムの特定の領域における特定のタンパク質または特定のタンパク質修飾の相対的な存在量を確認するために使用されます。 ChIPは、タンパク質とクロマチンの相互作用を含む多くの科学的な疑問に答えるために使用することができます。 たとえば、さまざまな遺伝子座における特定のタンパク質の存在を比較したり、関心のあるゲノム領域全体にさまざまなタンパク質をマッピングしたり、刺激に応じた誘導性遺伝子へのタンパク質結合を経時的に定量したりするために、ChIPを使用することができます。

ChIPの原理は比較的単純で、細胞や組織から抽出したタンパク質混合物から、特定のタンパク質、ヒストン、転写因子、補因子と、その結合したクロマチンを分離、または沈殿させるために抗体を使用することに依存している。 そのため、この手法の名前がついた。 クロマチン免疫沈降法（Chromatin Immunoprecipitation）。

ネイティブChIP（N-ChIP）と架橋ChIP（X-ChIP）とは？

ChIP技術には、実験課題や実験の出発材料に応じて2つのタイプがあります。 1) native ChIP (N-ChIP) と2) crosslinked ChIP (X-ChIP)です。 どちらのタイプのChIPにも利点と欠点がある：

1. N-ChIPでは、タンパク質とクロマチンを架橋するための固定剤を使用しない。 その代わりに、ヌクレアーゼで消化された細胞核からネイティブなクロマチンが単離される。 固定化されていない抗原に対して抗体を作成するため、抗体の標的抗原への認識・結合が良好であるという利点がある。 また、ヒストン蛋白質が豊富に含まれているため、下流の解析にPCRを必要としない場合もある。 これらの利点からN-ChIPは魅力的な方法であるが、ヒストンの検出にしか使用できない。 また、クロマチン消化や免疫沈降の過程でタンパク質の結合が失われると、データに偏りが生じたり、適切な解析ができなくなったりする。
2. X-ChIPでは、ホルムアルデヒドなどの化学固定剤を用いて目的のタンパク質をDNAに架橋し、超音波やヌクレアーゼ消化によりクロマチンを断片化している。 X-ChIPの利点は、ヒストンおよび非ヒストンタンパク質に使用できること、一般にN-ChIPよりも細胞由来の出発物質が少なくてすむことである。 また、X-ChIPは抽出中にクロマチンタンパク質が失われる可能性を最小限に抑え、一過性のタンパク質相互作用の検出を可能にする。

ChIPアッセイの種類は？

クロマチン免疫沈降法自体が完了すると、精製したクロマチンや関連タンパク質、ヒストン、転写因子、コファクターについていくつかのダウンストリーム解析を行うことができるようになる。 単一遺伝子解析ではqPCR、全ゲノム解析ではChIP-seqが最も一般的な方法である。 また、PCRやChIP-chipも下流の解析の選択肢となります。

5.1 ChIP-PCRの利点は？

ChIP-PCRは、ゲノム中のターゲット遺伝子座の既知のサブセットに対するヒストン修飾および/またはタンパク質結合を解析するために実行されます。 ChIP-PCRでは、免疫強化されたDNA断片が、広く利用されているPCRまたはqPCR試薬と技術を使用して同定され、定量されます。 ChIP-qPCRを用いることで、複数のサンプルにまたがるゲノム内の特定領域の迅速かつ定量的な比較が可能となります。

5.2 ChIP-chipの利点は？

ChIP-chip技術とは、ChIP-免疫強化DNA断片を分析するためにDNAマイクロアレイチップを利用することを指します。 ゲノムタイリングマイクロアレイ技術を用いることで、単離されたDNAに結合するタンパク質の全ゲノム解析が可能となり、タンパク質結合やタンパク質修飾の高解像度ゲノムマップを作成することができます。 ChIP-chipは、基礎研究だけでなく、疾患を対象とした研究にも多面的に利用されています。 例えば、転写因子、エンハンサー、リプレッサーの結合部位の同定や、対照試料と病的試料におけるこの種の結合タンパク質の比較に用いることができる。 しかし、NGSのコストが大幅に低下し、ChIP-seqを使用して同様の結果が得られるため、ChIP-chipの代わりにChIP-seqを実施することを選択する人が増えています

5.3 ChIP-seqの利点は何か

ChIP-chipと同様、ChIP-seqではゲノム全体のタンパク質結合についての情報が得られます。 しかし、ChIP-chipとは異なり、ChIP-seqはNGS技術を使用してDNA断片を特定し、ゲノム全体に対してマッピングします。

より現代的なDNA増幅技術により、少ない入力DNA量で数日のうちに堅牢な分析を実施することが可能です。 出発材料が乏しい場合、ライブラリ調製法におけるこれらの技術的進歩により、ChIP-seq実験が可能になりました。

さらに、DNAサンプルにバーコードとして知られる短い配列で一意にタグ付けする新技術により、個々の断片を単一のシーケンスレーンにプールして多重化分析することができるようになりました。 このように、DNAシーケンシング技術の進歩により、ChIP-seqの利点は、大量のChIP富化DNAサンプルを、ChIP-chipよりも高い感度と精度で、比較的短時間で安価に配列決定できることです

ChIP assayにはどのようなステップがありますか？

ChIPアッセイは一般的なプロトコルに沿って行われます。

1. X-ChIPのみタンパク質をDNAに架橋
2. 細胞溶解
3. 消化（X-ChIPおよびN-ChIP）または超音波照射によるクロマチン断片化
4. 細胞溶解（X-ChIP）または超音波（N-ChIP）

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5. 特異的抗体を用いた免疫沈降
6. ダウンストリーム解析のためのDNAクリーンアップ
7. PCRによるDNA解析

X-ChIPのみ。 qPCR、マイクロアレイ、またはNGS

重要なのは、各ステップでの陽性および陰性コントロールが、ChIP実験が成功したかどうかを判断するために不可欠であるということです。

6.1 ChIPのための細胞や組織の架橋方法

架橋試薬は、タンパク質が結合するDNAに「固定」するために使用されます。 この固定を実現するために、一般的にはホルムアルデヒドベースの試薬が使用されます。 細胞や組織も一般に同様の方法で固定されますが、組織は変性し始める前に標的組織に素早く浸透させるため、より長い固定時間とより迅速な固定送達が必要です。

クロマチンの過剰固定は、抗体のタンパク質標的への結合を阻害するだけではなく、超音波処理による断片化の効率も低下させる可能性があります。 そのため、タンパク質とその標的DNAとの理想的な架橋を達成しながら、抗体と抗原の結合を最大化できるように、固定時間を経験的に決定すべきである。

6.2 クロマチンの断片化は？

ChIP実験の成功にはクロマチンの断片化は不可欠である。 クロマチンの断片化はクロマチンを可溶化し、共沈を可能にするために必要です。 また、DNA断片のサイズがChIPアッセイの分解能を決定するため、クロマチンの断片化に依存する。

酵素消化では、ヌクレオソーム間の二本鎖DNAを切断するマイクロコッカルヌクレアーゼ（MNase）を用いて、クロマチン断片を生成させる。 MNaseの完全消化では150塩基対のDNA断片（モノヌクレオソーム）が、不完全消化では150～750塩基対のDNA断片（モノ、ジ、トリヌクレオソーム）が生成される。 ソニケーションは、機械的な力を利用してクロマチンを断片化する。 X-ChIPでは、クロマチンをせん断するために、酵素消化または超音波処理のいずれかが使用されます。 超音波処理ChIPプロトコルの超音波処理条件は、細胞の種類や実験条件によって異なるため、経験的に決定する必要がある。 消化条件は細胞種や組織によって異なるが、クロマチン断片のサイズはIPの前に分析する必要がある。

N-ChIPでは、未固定のサンプルでタンパク質結合を維持するために、ヌクレアーゼを用いてクロマチンを断片化させる。

6.3 ChIPに酵素消化を用いる理由

N-ChIPでは、タンパク質がDNAに架橋されておらず、超音波処理による断片化に伴う過酷な条件では、DNAからクロマチンタンパク質が解離するため、核酸分解を用いる必要があります。 ヒストンとDNAの結合は非常に強固で安定しているため、N-ChIPはヒストン蛋白質とDNAの相互作用の解析に理想的である。 しかし、N-ChIPは転写因子や補酵素のクロマチン結合の解析には向かない。

X-ChIPでクロマチンを断片化するには、酵素分解か超音波照射のどちらかを用いることができる。 酵素消化の利点は、断片化の一貫性と穏やかな断片化条件（低熱と洗剤）により、クロマチンと抗体エピトープの完全性をよりよく保存できることで、転写因子や補酵素結合クロマチンの免疫エンリッチメントが増加する。

6.4 ChIPのために超音波処理を用いる理由

酵素消化によるクロマチン断片化とは異なり、超音波処理は機械力を利用してクロマチンを小さな断片に断片化している。 免疫強化のためのクロマチン断片の理想的なサイズは、200から1000塩基対の間です。 ソニケーションはクロマチンを断片化するために用いられる伝統的な方法であり、従来のプローブソニケーターや、より集中的なソニケーションが可能なウォーターバスソニケーターを用いて実行することができる。 ソニケーションは、クロマチンの真にランダムな断片を生成する。しかし、異なる細胞株や組織で広範囲に最適化する必要があり、実験ごとに再現することは困難である。

6.5 ChIPにおけるクロマチン超音波処理の最適化

超音波処理によるクロマチン断片化は、従来、高い洗剤バッファーを使用し、熱を発生させるため、クロマチンや抗体エピトープの完全性にダメージを与える可能性がある。 そのため、クロマチンの断片化に使用する超音波の量は、異なる細胞株や組織に対して実験的に決定する必要がある。 qPCR、DNAチップ、またはNGSによるダウンストリーム解析を伴う完全なChIPアッセイに着手する前に、ゲル電気泳動を使用して、さまざまな時間超音波処理したクロマチン試料を分析する必要があります。 フラグメントサイズは超音波処理時間に依存する-超音波処理時間が長くなると、フラグメントサイズは減少する。 しかし、超音波処理時間を長くしても、良い結果が得られないことがデータから示唆されている。 したがって、精製した免疫沈降DNAをゲル上で泳動し、理想的なフラグメントサイズを決定することは、目的のDNAサイズに必要な最小限の超音波処理量を決定し、クロマチンへの不必要な損傷を避けるための簡単な方法である

6.6 ChIPのための抗体の選び方

ChIP実験の成功には、適切な抗体を選ぶことが不可欠です。 ChIP実験に使用する抗体は、目的のタンパク質に特異的で、抗原に対して高い親和性を持っている必要があります。 ChIPまたはChIP-seq実験に最適な抗体は、ChIP-validatedまたはChIP-seq-validatedの抗体です。 目的の遺伝子に対して利用可能なChIPバリデートされた抗体がない場合、次善の策としてIPでバリデートされた抗体を選択することができます。 IPでバリデートされた抗体がすべてChIPで機能するわけではなく、ChIPでバリデートされた抗体がすべてChIP-seqで機能するわけでもないことに注意が必要です。 さらに、ウエスタン、IP、IF、フロー、IHCなど、他のアプリケーションでバリデートされた抗体ほど、抗体の性能と特異性に対する信頼性が高くなります。