内視鏡検査に代わる早期胃癌検出のためのスクリーニングバイオマーカー: 血清Trefoil Factor Family 3とPepsinogenの併用

Abstract

目的. 血清ペプシノーゲン検査は、胃がん検診の非侵襲的バイオマーカーとしての予測力に限界がある。 そこで，TFF3とペプシノーゲンを併用することで，早期胃癌の発見に有効なバイオマーカーとなりうるかどうかを検討することを目的とした。 方法 韓国で内視鏡的粘膜下層剥離術を受けた早期胃がん（EGC）患者281名と日本の健常者708名を派生コホートとして登録した。 検証コホートには、韓国のEGC患者30名と韓国の健常対照者30名が含まれた。 血清中のTFF3濃度は、酵素結合免疫吸着法を用いて検討された。 結果は以下の通り。 派生コホートにおいて6.73 ng/mLのカットオフ値を用いた場合、EGC検出のための組み合わせ検査の感度は、TFF3（80.4%）またはペプシノーゲン検査単独（39.5%）より優れていた（87.5%）。 同様に、検証コホートでは、TFF3＋ペプシノーゲン検査の感度は、TFF3（80.0％）またはペプシノーゲン検査単独（33.3％）よりも高い（90.4％）ことが確認された。 結論 血清TFF3とペプシノーゲンの併用は、ペプシノーゲンまたはTFF3単独と比較して、EGCでも胃がん検出のための非侵襲的バイオマーカーとしてより有効であることが示された。 本試験はNCT03046745.

1に登録されています。 はじめに

胃がんは、世界におけるがん死亡原因の第3位である。 胃がんの約半数は進行した状態で診断される。 その理由の一つは、食道胃十二指腸内視鏡（EGD）検診の侵襲性が高く、患者が必要な検査を回避してしまうことである。 非侵襲的な血清バイオマーカーとしてのペプシノーゲン検査の限界は、最適なカットオフ値が、H. pylori感染、年齢、性別、検査方法など、いくつかの要因に影響される可能性があることである。 TFFは酸性条件下で極めて安定であり，熱分解やタンパク質分解に対して抵抗性がある。 TFF は、3 種類のペプチドからなるファミリー（TFF1, TFF2, TFF3）を構成し、消化管において組織特異的に広く発現している。 TFF3は、小腸、大腸の杯細胞、胃の腸上皮細胞に発現している。 血清TFF3は、日本ではペプシノーゲンよりも優れた胃がんスクリーニングツールであることが示された。

これらのTFF3の特徴から、我々は血清TFF3が日本人集団と同様に韓国人の早期胃がん（EGC）のバイオマーカーとなり得るかどうかを分析した。 進行胃癌（AGC）のないEGC集団におけるバイオマーカーとしての血清TFF3に関する先行研究はない。 早期がんの発見は生存率の向上につながるため、TFF3とペプシノーゲンの組み合わせはEGCの検出感度を向上させる可能性があるというのが我々の仮説である。 そこで、血清TFF3とペプシノーゲン検査の組み合わせが、より効果的なEGCの非侵襲的検出ツールとなり得るかどうかを検討した。 材料と方法

2.1. 対象者＜774＞＜9784＞2.1.1. Study Population of Derivation Cohort

患者群は、2011年1月から2013年5月に韓国のKyungpook National University Medical Centerで内視鏡的粘膜下層剥離術を受けたEGC患者281名である。 内視鏡治療前に全患者から血液サンプルを採取した。 対照群は、2011年10月から2012年12月まで日本の山中医院で健康診断を受けた健康な男女708名の献血者である。 本研究のための生検検体は、保健福祉省の支援を受けている韓国の国立バイオバンク、慶福大学病院（KNUH）より提供された。 National Biobank of Korea, KNUHに由来するすべての材料は、機関審査委員会承認のプロトコルに基づいて入手された

2.1.2. 検証コホートにおけるTFF3値

本研究の派生コホートでは、対照群は日本人で構成されており、対照群における血清ペプシノーゲンの結果は得られていない。 患者も対照者も同じ国の別の検証コホートで今回の結果を検証するためには、韓国の検証コホートが必要であった。 検証コホートは独立したコホートで、2016年8月から2016年12月の韓国人EGC患者30名と、2016年8月から2016年12月にEGDを含む健康診断を受けた韓国人健康対照者献血者30名を含んでいた。 彼らのデータは、TFF3値を検証するためにプロスペクティブに収集され、分析された。 検証コホートの被験者に使用した試験プロトコルは、導出コホートの被験者に使用したものと同一であった。 韓国人におけるEGC検出のためのTFF3とペプシノゲンの組み合わせの妥当性は、受信者動作特性（ROC）分析によって評価された

2.2. 方法＜774＞＜9784＞2.2.1. ヒトTFF3発現プラスミドの構築

Human Small Intestine Marathon-Ready cDNA (Clontech, Mountain View, CA, USA) からポリメラーゼ連鎖反応によりヒトTFF3相補的デオキシリボ核酸 (cDNA) をクローン化した。 Hisタグ付き大腸菌発現のため、ヒトTFF3 cDNA断片をpET-21a(+) (Novagen) ベクターに挿入し、pET-hTFF3-His .

2.2.2. 組換えヒトTFF3

BL21-CodonPlus (DE3)-RIL bacteria (Stratagene, Santa Clara, CA, USA) をpET-hTFF3-Hisプラスミドでトランスフォームし、リゾジェニーブロス培地で37℃にて培養を行った。 組換えタンパク質の発現は、1 mmol/L イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドと共に5時間インキュベートすることによって誘導された。 菌体ペレットを採取し、0.2% Triton X-100 および 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) で超音波処理して可溶性タンパク質画分を抽出し、Ni-Resin クロマトグラフィー (Invitrogen, Tokyo, Japan) で組換えヒト TFFsを精製した。 Ni-Resin カラムから 0.5 mol/L イミダゾール、50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) および 0.5 mol/L NaCl でリコンビナントヒト TFF を溶出させた。 各溶出画分は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動とウェスタンブロット分析を行うことにより、解析した。 精製したリコンビナントヒトTFFの濃度は、プロテインアッセイ（株式会社バイオラッドラボラトリーズ、東京、日本）を用いて測定した＜855＞ ＜9784＞2.2.3. TFF3、Pepsinogen I、Pepsinogen II、Helicobacter pylori感染状況に関する免疫測定法

血清中のTFF3濃度は、酵素結合免疫吸着法（ELISA）により測定された。 抗血清は、ヒトTFFを免疫したウサギから調製した。 TFF3の感度は30 pg/mLであった。 血清ペプシノーゲンIとペプシノーゲンII濃度はラテックス増強比濁免疫測定法（日立製作所、東京）で測定し、ペプシノーゲンI/ペプシノーゲンII比を算出した。

H. pylori感染状態が陽性かどうかは、感染の証拠を示す次の検査のうち少なくとも1つによって決まる：組織検査、迅速尿素検査、-尿素呼吸検査

2.3.血清ペシノーゲンIとペプシノーゲンII濃度は、組織検査では1,000ppm、迅速尿素検査では1,000ppm、-尿素呼吸検査では1,000ppmだった。 統計解析

すべての統計解析は、JMP7ソフトウェア（SAS Institute Inc.、Cary、NC、USA）またはSPSS version 14.0（SPSS Inc.、Chicago、IL、USA）を使用して実施した。 変数の平均値はt検定を用いて2群間で比較した。 各評価のROC曲線は、異なる胃の状態を識別するために使用できる、対応するカットオフ点を抽出するために使用された。 そのために、モデルの識別能力を測定するために、各 ROC 曲線の下の面積を使用した。 その結果得られた各評価のカットオフポイントの値を感度、特異度、オッズ比の決定に適用した。 その結果，95%信頼区間が算出された． 両側0.05未満を統計的に有意とした。 派生コホートと検証コホートの特徴

派生コホートでは，EGC群の男性患者数は217名（75.8％），対照群は272名（38.4％）であった。 癌群の平均年齢は63.4±9.3歳，対照群の平均年齢は67.4±11.9歳であった。 がん群におけるH. pylori感染陽性率は48.4％であった。 281の腫瘍のうち、256（91.1％）が分化型、25（8.9％）が未分化型に分類された（表1）。 胃がん患者の平均血清TFF3値は9.37 ± 4.67 ng/mLで、対照群（7.05 ± 3.28 ng/mL）と比較して有意に高値であった（表1、図1）。

検証コホートでは、韓国のEGC患者30人と韓国の健常対照者30人が登録された（表1）。 EGC群では21名（70.0％）、対照群では15名（50.0％）の男性患者が存在した。 EGC患者の平均年齢は59.5±10.7歳であり、対照群の平均年齢は66.6±12.0歳であった。 胃がん患者の平均血清TFF3値は9.01±4.21ng/mLで、対照群（6.92±2.76ng/mL；）より有意に高値であった。 派生コホートにおけるH. pylori感染が血清TFF3レベルに及ぼす影響

がん患者におけるH. pylori感染を特定するための血清TFF3の診断精度を検証するために、ROC分析を行った（データは示されない）。 TFF3のROC曲線下面積は0.445であった。

EGCを識別するための血清TFF3の診断精度を検証するために、ROC分析を行った。 H. pylori陽性患者とHelicobacter pylori陰性患者の両方において、TFF3の感度、特異度、オッズ比、曲線下面積、カットオフ値は、それぞれ0.804、0.576、5.60、0.729、6.73であった。 また、TFF3の陽性予測値は0.430、陰性予測値は0.881であった（図2（a））。 さらにTFF3を評価するために、患者をH. pyloriの感染状態によって分け、ROC解析を行った。 その結果、曲線下面積はH. pylori陽性患者で0.716（図2（b））、H. pylori陰性患者で0.740（図2（c））であり、H. pylori陽性患者の方がTFF3が優れていることがわかった（図2（c））。

(a)

(b)

(b)
(c)

(a)
(b)
(c)

3.3.1.2.3.3. 派生コホートにおける組織型と血清TFF3レベル

EGCが血清TFF3レベルに及ぼす影響を検証するため、各患者の血清中のTFF3レベルをEGCの組織型と比較検討した。 分化型胃癌は高分化型または中分化型腺癌の症例が含まれた。 未分化型胃がんは、低分化型腺がんや印環細胞がんを含む組織型であった。 EGCの分化型と未分化型の血清TFF3値に有意差はなかった（それぞれ9.53 ± 4.83 ng/mL vs 7.66 ± 1.82 ng/mL, )。 一方、腸管型EGCの血清TFF3値は、びまん型EGCに比べ有意に高かった（それぞれ9.54 ± 4.78 ng/mL vs 7.16 ± 1.89 ng/mL、；図3）。 粘膜下浸潤やリンパ管浸潤など、その他のEGCの病理学的状態においても、血清TFF3値に有意差は認められなかった（データ未掲載）。

(a)

(b)

(a)
(b)

3.4. 派生コホートにおける血清TFF3検査とペプシノーゲン検査の併用

TFF3値をペプシノーゲン検査と併用することの有用性を分析した。 本研究における胃癌患者数と両検査の陽性・陰性を表2に示す。 ペプシノーゲン検査陽性判定のカットオフ値は、血清ペプシノーゲンI値＜1282＞70ng/mL、血清ペプシノーゲンI/II比＜1282＞3とした。 このカットオフ値では、EGC患者281人のうち170人はペプシノーゲン検診単独では癌でないことが示された。 しかし、胃がん検診に血清TFF3検査を追加したところ、ペプシノーゲン検査で同定できなかったEGC患者170人のうち135人がTFF3検査で同定できるようになった。 一方、TFF3検査では発見されなかったがペプシノゲン検査では発見された患者281名のうち20名が発見された。

個々のペプシノーゲン、TFF3検査の感度はそれぞれ39.5％、80.4％であった。 併用検査では、胃がん有無の感度は87.5％となり、TFF3検査単独よりも高かった

3.5. 韓国検証コホートにおける血清TFF3とペプシノーゲン検査の併用

韓国検証コホートにおけるペプシノーゲン検査と血清TFF3のEGC識別に対する診断能力を検証するために、ROC解析を行った（図4）。 ペプシノーゲン検査の定義によるEGCの検出に対する感度、特異度、オッズ比、曲線下面積はそれぞれ0.333、0.933、7.00、0.633であった。 TFF3のカットオフ値6.73 ng/mLを用いた場合、TFF3はそれぞれ0.800、0.433、3.06、0.651となった。 また、TFF3とペプシノーゲンL/L比の組み合わせでは、それぞれ0.900、0.367、5.21、0.756となった。

pepsinogen l/ll ratioの陽性・陰性予測値はそれぞれ0.833と0.583，TFF3の予測値は0.585と0.684であった． TFF3とペプシノーゲンL/L比の組み合わせでは、それぞれ0.587と0.786であった。 議論

ペプシノーゲン検査は、日本では胃がんスクリーニングに用いられており、集団ベースの研究では、検査の感度71%から84%、特異度57%から78%であった。 本研究では、韓国人患者におけるEGC検出のための血清学的スクリーニングツールとして、血清TFF3と血清ペプシノーゲン検査を比較した。 ペプシノーゲン検査の感度は39.5％であり、日本の研究より感度が低い。 胃癌のペプシノーゲン検査は、ピロリ菌の状態や検査方法など様々な要因に影響されやすく、理想的なスクリーニング基準とは言えないようである。 一方、血清TFF3検査は、ペプシノーゲン検査よりも高い感度（80.4%）でEGCを検出することができた。 さらに、血清TFF3検査の結果は、H. pyloriの状態によって影響を受けなかった。 同様に、健康な1260人を対象とした最近の日本の研究では、血清TFF3値は、H. pyloriの状態および除菌にあまり影響されないことが示された。 著者らは、血清TFF3が、ペプシノーゲン検査とは対照的に、ピロリ除菌後でも安定した胃癌のバイオマーカーになる可能性を示唆した 。 TFF3は胃の上皮細胞では発現しておらず、腸の杯状細胞でのみ発現しているため、血清TFF3値はH. pylori感染の影響を受けにくい。

TFF1、TFF2、TFF3からなるTFFは粘液産生細胞を含む組織で高度に発現している。 粘膜の健全性の維持、固形癌の癌化、成長、転移拡大に重要な役割を担っている。 TFF3は小腸や大腸の杯細胞、胃の腸上皮細胞で発現している。

最近のデータでは、血清TFF、特にTFF3が胃がん検出のためのバイオマーカーとなる可能性があることが示された。 胃がん患者183名と健常者280名を対象に行われた日本の研究では、TFF3のカットオフ値を3.6ng/mLとしたところ、胃がんのオッズ比が有意に上昇し（オッズ比18.1；95％信頼区間11.2-29.2）、胃がん予測の感度と特異度はそれぞれ80.9と81.0％となった …。 ペプシノゲンI/II比、TFF3、TFF3＋ペプシノゲンI/II比のROC曲線を比較すると、TFF3＋ペプシノゲンはペプシノゲンまたはTFF3検査のみより胃のスクリーニングマーカーとして優れた結果を示すことがわかった . 胃がん患者192名と対照者1254名を対象にした別の研究では、ペプシノーゲン検査の胃がん予測に対する感度と特異度はそれぞれ67％と82％であり、血清TFF3とペプシノーゲン検査の併用は胃がん検出に対する感度が80、特異度が80％であることが示されました . これらの過去の結果は、EGC患者を対象とした我々の研究の結果と一致する。 また、血清TFF3とペプシノーゲンの併用検査とTFF3またはペプシノーゲンのみの検査を比較したところ、TFF3とペプシノーゲンの併用検査は胃癌の検出に有効であった。 EGCの存在を予測するためのTFF3のROC曲線は、派生コホートにおいて6.73 ng/mLのカットオフ値を用いて、感度、特異度、曲線下面積はそれぞれ80.4%、57.6%、0.729であった。 EGCの検出感度は87.5％と，TFF3（80.4％）およびペプシノーゲン（39.5％）より優れていた． 同様に，検証コホートにおいて，TFF3のROC曲線は，カットオフ値を6.73 ng/mLとした場合，感度，特異度，曲線下面積がそれぞれ80.0％，43.3％，0.651となり，TFF3の方が優れていた． また、TFF3＋ペプシノーゲンI/II比の曲線下面積（0.756）は、TFF3単独（0.651）、ペプシノーゲンI/II比単独（0.633）に比べ、高い値を示しました。 また、TFF3＋ペプシノーゲン（90.0%）は、TFF3（80.0%）やペプシノーゲン検査のみ（33.3%）よりも高い感度を有していました。 TFF3はペプシノーゲン検査よりもEGCの検出に有用なマーカーであり、血清TFF3＋ペプシノーゲンの併用はTFF3またはペプシノーゲン単独よりも有効である。

また、TFF3とEGC組織型の関係を分化度とローレン分類によりそれぞれ評価した。 その結果、分化型胃がん患者の血清TFF3値は未分化型組織型の患者よりも高かったが、これらの差は統計学的有意差を示さなかった（）。 腸管型胃癌患者の血清 TFF3 値は、拡散型胃癌患者よりも有意に高かった ()。 Huangらは、分化型および腸型胃癌の中国人患者において、血清TFF3濃度が低いことを報告している。 したがって、我々の研究の結果は彼らの報告とは一致しない。 一方、日本の貝瀬らの報告では、びまん型腺癌ではTFF3単独検査、TFF3とペプシノーゲン検査の併用で腸型癌より感度が低いという結果となり、本研究は非常に整合的であった。 TFF3は（胃癌の組織病理学によれば）胃の腸上皮の杯細胞で強く発現しているので、腸型胃癌と分化型胃癌ではTFF3の血清レベルが高いことが予想される。

EGDは、特に多くの無症状者において、胃がんの早期発見に用いられる侵襲的な検査である。 血清TFF3とペプシノーゲンの組み合わせで胃がんが陽性であれば、患者にEGDを受けるよう促すのに役立つかもしれない。

本研究にはいくつかの限界があった。 一つは、サンプル数が比較的少ないことである。 しかし，本研究は2つの独立したコホートを通じて同様の結果を示し，AGCではなくEGC患者のみを対象としたTFF3の診断的有用性に関する最初の研究である。 第二に、拡散型EGCの割合が少なかったことである。 しかし、韓国の先行研究では、同様の結果が示され、EGCの割合は49.4％であったが、腸型胃癌と比較して、拡散型癌の血清TFF3の診断価値はやや低下していると報告された。 第三に、派生コホートにおける対照者は健康な日本人であり、韓国人ではなかった。 この点を克服し、本研究を検証するために、独立した2番目の韓国人コントロールコホートを分析したところ、両コホートの結果は同様であった。 第四に、我々の研究は、TFF3によって萎縮性胃炎を含む前癌病変の検出性を示さなかった。

まとめると、本研究は、血清TFF3が韓国人のEGCのバイオマーカーとしてペプシノーゲン試験よりも有効であることを示している。 さらに、TFF3とペプシノーゲン検査の併用は、スクリーニング手段としての診断力を高めた。 さらに、血清TFF3値は、EGCの組織型および分化型と関連する可能性が示唆された。 AGCまたはEGC患者における血清TFF3およびTFF3とペプシノーゲンとの組み合わせ検査の強い予測力を確認し、また胃癌の集団ベースのスクリーニングにおける非内視鏡的バイオマーカーとしての血清TFF3の役割を明らかにするために、さらなる大規模研究が必要である。

利益相反

著者らは、本論文の発表に関して競合する利益がないことを宣言する。

謝辞

本研究（臨床試験情報：NCT03046745）は、韓国保健福祉部&がん対策国家研究開発プログラムからの助成（1631100）により行われたものです。