生物活性試験-抗連鎖球菌活性
3種類の緑茶と5000rpmと10000rpmと20000rpmで得られた抽出物と粒子に対して、歯科病原菌S.mutansの抗菌性を検討しました。 さらなる実験のために緑茶抽出物の濃度を最適化するために、GT-0（粒子を除去していない）およびGT1、GT2、GT3からの5K-Sの6種類の濃度（0μL、50μL、100μL、200μL、300μL、500μL）をS.mutansに対して試験しました。 図2に、この試験の結果を示す。 図2（a）から観察されるように、分光光度法では、3つの緑茶すべてに関して、GT-0および5K-Sの場合、濃度の増加とともに抗連鎖球菌活性が増加することが判明した。 300μLの濃度が最適な抗菌活性を示すことが観察され、それゆえ、本研究の他のすべての実験のための最適化濃度として区別された。 したがって、これ以降、すべての実験は、緑茶変数の300μL濃度を用いて実施された。 図2（b）は、全生存数法を用いた抗菌性評価によって得られた結果を示している。 プレートカウントの結果は、分光光度計による濁度測定の場合に観察された結果と相関している。 これらの結果から観察されるもう一つの興味深い観察は、GT-0と比較して、5000rpm（5K-S）で粒子を除去する際に観察される抗菌活性の限界的な改善である。 GT 1-0と比較して、GT 1-5K-Sは、GT 2およびGT 3の場合と同様に、抗菌活性の増加を示した。 さらに、GT 3が最も高い抗菌活性を示し、GT 1が最も低い抗菌活性を示すことが観察された。
(a) 分光光学濃度法と (b) 全生存数法による抗菌活性に対する試験変数の濃度影響の最適化。
緑茶から粒子を除去すると、緑茶抽出物の生物活性に変化が見られたため、この効果を調べるために詳細な調査をすることが提案されました。 5000rpm、10000rpm、20000rpmの3段階の遠心分離を行い、抽出物から大きな粒子、小さな粒子、さらに小さな粒子を分離することを目的とした。 大粒子（5K-S）、小粒子（10K-S）、微粒子（20K-S）の抽出物リッジと粒子（5K-P、10K-P、20K-P）について、S. mutansとの相互作用と個々の抗菌活性を検討した。 図3にこの研究の結果を示す。 図3（a-1，a-2）に見られるように、濁度に基づく方法とプレートカウント法の両方により、GT1に関しては、5K-Pを除去することにより、GT1-0と比較して抽出物（5K-S）の抗菌活性が増強（限界増強）することが、確認された。 また、10K-Pを除去してもそれ以上の増強は認められず、10K-Sは通常5K-Sと同程度の活性であることが確認された。 しかし、20K-Pの除去により、20K-Sでは抗菌活性が明確に失われた。 この観察は、GT 2 (Fig. 3(b-1,b-2)) とGT 3 (Fig. 3(c-1,c-2)) の場合に顕著であることが観察された。 この傾向は、GT1→GT2→GT3とばらつきがあるものの、抽出物から大きな緑茶粒子を除去すると緑茶抽出物の抗菌性がわずかに向上し、抽出物から小さな緑茶粒子画分を消去すると緑茶の抗菌活性が明確に低下するという事実は疑問の余地が残らない。
(a)GT 1、(b)GT 2、(c) GT 3 の各種試験成分の抗菌活性を (a,b,c -1) 分光光度法と (a,b,c -2) 総活量法により比較したグラフである。
しかし、ここで強調したいのは、5K-P、10K-P、20K-P粒子のいずれも抽出物よりも高い単独での抗菌活性を示さなかったことである。
Real time testing of dental bactheria
緑茶抽出物と緑茶粒子の生物活性の変化をリアルタイムシステムで評価するために、抽出物は5人の異なるヒトボランティアからの歯のバイオフィルムの実際のサンプルと対決させた。 GT 1、GT 2、GT 3のGT 0、5K-S、20K-Sがテストされました。 図4は、プレートカウント法による総生存数で、緑茶との相互作用に耐えた細菌を示しています。 サンプルの複雑さにもかかわらず、GT 0と比較して、5K-Sは抗菌活性の向上を示し、20K-Sは3つの緑茶すべてに関して抗菌活性の低下を示したことは興味深いことであった。
5人のヒトボランティアから得た実際のサンプルで実証した歯科抗菌効果の成功を示す結果である。
アクリジンオレンジを用いた細胞の蛍光イメージングにより、処理後の生細胞/死細胞の可視化と区別を支援。 我々は、GT 0、5K-S、20K-S、およびコントロールとの相互作用の前と後に、5人のボランティアからの歯科バイオフィルム・サンプルを画像化した。 図5は、ボランティア1（A）、ボランティア2（B）、ボランティア3（C）、ボランティア4（D）及びボランティア5（E）に対する緑茶変数の効果を示す蛍光結果を示している。 図5（a）から観察されるように、A、B、C、D及びEのコントロール画像は、活発に代謝している生きた歯科用細菌の存在を示す優勢なオレンジ色の蛍光を示す。 画像から観察されるように、歯から外れたバイオフィルムは、そのバイオフィルムのアイデンティティを保持し、コントロールの場合には微生物マットのように見える。 GT 0処理では、すべてのボランティアにおいて、緑茶に期待される十分に予想される殺傷効果が得られた（図5（b））。 緑色の蛍光を発する部分（死細胞）が優勢であり、その中にオレンジ色の蛍光を発する部分が共存していた。 パネル(c)は、GT 3の5K-S上清から、緑茶の最大粒子を取り除いた抽出液の結果である。 蛍光顕微鏡の画像から観察されるように、オレンジ色の蛍光は観察されず、完全な緑色の蛍光が歯科用細菌/バイオフィルムの完全な消滅を表しています。 また、すべての試験サンプル（A（c）、B（c）、C（c）、D（c）、E（c））において、バイオフィルムのパッチやマットはもはや観察されず、バイオフィルムマットは崩壊し、見られるのは散在した細胞の塊だけであることは興味深いことである。 最後に、図5(d)は20K-S相互作用の結果を示しており、緑茶抽出物の殺傷効果の著しい低下が明らかである。 オレンジ色の蛍光を発する生菌の発生は、ナノ緑茶成分の除去に伴う抽出物の抗菌活性の低下を示している。 また、緑色の蛍光を発する死細胞も観察されたが、生細胞と死細胞の比率は変化しているようであった。 これらの結果は、分光光度法およびプレートカウント法で報告された各種試験用緑茶成分の抗菌活性の傾向を確認するものであった。
(A) Volunteer 1 (B) Volunteer 2 (C) Volunteer 3 (D) Volunteer 4の口腔バイオフィルムの死活状態をイメージングしたエピフルオロスコピックな顕微鏡写真は（a）コントロール（GT成分なし） (b) GT 0 (c)5K- (d)のもので、（A）ボランティア1の口腔バイオフィルムの生死は（B）ボランティア2の生死は（C）ボランティア3の生死は（D）のものである。S (d) GT 3に属する20K-S。
コントロールと5K-Sの相互作用した歯科用細菌のFE-SEM観察を図6（a-c）に示す。 図から観察されるように、コントロール（図6（a））は、よく発達したバイオフィルム（ボランティア4）を示すが、GT 3と5K-S（図6（c））の相互作用のGT 0（図6（b））は、細胞破片が示すように、細胞とバイオフィルムに損傷を与える結果となった。 CLSMを用いて撮影した画像（d）は、5人のボランティア全員からの歯科用細菌の大部分が、GT 3（5K-S）によって死滅したことを示す。 GT 3-GT 0および5K-Sは、すべてのボランティアからの歯科細菌に対して最も有望であることが分かった。
V4 からの歯科サンプルのSEM画像 (a) コントロール（未処理） (b,c) GT 3処理、緑茶との培養後の広範囲にわたる損傷を見せています。 (d)は、細胞のCLSM画像を示し、蛍光を発する細胞は、GT 3 20K-P’sでの処理後の5人の異なるボランティアにおける死細胞を表している。
抽出物及び粒子の特性化
緑茶成分の抗菌活性に基づく生物活性試験の結果が、緑茶粒子の存在及び不在が実際に抽出物の活性を変えることを示しているので、三つの緑茶の抽出物GT 0, 5K-S, 10K-S 及び 20K-S と次に粒子 5K-P, 10K-P 及び 20K-P が精密に特徴付けられることが必要である。
Biochemical characterization
抗菌活性は一般に抽出物の総フェノール、フラバノイドおよび抗酸化能に支配される。 これらのパラメータはすべて、本研究で採用した抽出物と粒子の中で研究され、比較された。 図7（a）は、GT 1の場合に得られた結果を示す。フラバノイドの場合、グラフから観察されるように、GT 0、5K-S、10K-Sおよび20K-S抽出物の間でフラバノイド含量に大きな違いは観察されず、GT 0は他のものと比較して限界的増加を示すようであった。 しかし、緑茶粒子の場合、5K-Pが最も高いフラバノイド含量を記録し、10K-Pと20K-Pは抽出物に見られるのと同様の範囲のフラバノイド含量でそれに続いた。 GT 2 Fig. 7 (b) と GT 3 Fig. 7 (c) では、フラバノイド含量が異なり、5K-Sと10K-S抽出物はGT 0と比較して最も高いフラバノイド含量を示している。 例外として、20K-S抽出物は他の抽出物に比べて少ないフラバノイドを示し、20K-P粒子は他の粒子に比べて高いフラバノイドを示した。
(a) GT 1 (b) GT 2 (c) GT 3成分の抗酸化活性（DPPH使用）、フラボノイド含量（AlCl3法）、総フェノール量（Folinのメソッド）に基づいての生化学活性を比較したものです。
総フェノール量に関しては、GT1ではGT0が最も高く、他は低い値を示しました。 しかし、GT 2とGT 3の場合には、すべての抽出物がほぼ同様のフェノール含量を示した、フェノール含量の場合に同様の傾向が観察されたことが再び観察された。 しかし、5K-Pと10K-Pは20K-Pに比べて最も少ないフェノール含量を示した。
抗酸化活性については、GT 1抽出物（GT 0, 5K-S, 10K-S, 20K-S）は非常に高い抗酸化活性を示し、5K-Pと10K-Pは6倍も低い抗酸化活性を示した。 しかし、ここで言及する必要があるのは、20K-Pのものが5K-Pと10K-Pに比べ、有意に高い抗酸化活性を示したことである。 GT 2とGT 3ではこの傾向がより顕著で、5K-Sと10K-SはGT 0と比較して高い抗酸化活性を示した。しかし、20K-Sの場合には抗酸化活性の明確な低下が観察され、GT 2とGT 3の20K-Pの活性はそれに対応して上昇した。 この傾向は、GT 3 > GT 2 > GT1の順であった緑茶の抗菌生物活性と強く相関している。
FE-SEM analysis
5K-P, 10K-P および 20K-P 粒子を FE-SEM で画像化して、形態的詳細とサイズを確認した。 図8はGT1（A），GT2（B），GT3（C）の粒子の5K-P（a），10K-P（b），20K-P（c）の形態を示している。 ほとんどの場合、明確な形状のない不規則な形態が観察された。 図8からわかるように、GT 1とGT 2の5K-P粒子はマクロサイズであることが観察され、これらは私たちが緑茶のカップで目にすることができるものである。 表1は、それらのサイズを示し、GT2（B）5K-P粒子が最も大きく（50〜80μm）、次いでGT1（B（a））は15〜25μmのサイズ範囲であった。 GT 3 5K-P粒子は6〜30μmの範囲で比較的小さかった（図8(C(a)))。 顕微鏡写真で観察されるように、粒子は、このような粗製で標準化されていない市販のサンプルに期待される、一定の大きさではありませんでした。 10K-P粒子は、GT1の場合、4〜10μmのマイクロサイズの範囲であり（A（b））、GT2は2〜10μm（図8B（b））、GT3は0.5〜3μmのサイズ範囲であった（C（b））。 20K-P粒子はより小さなマイクロサイズからナノサイズであり、GT 1粒子は0.5〜6μm領域（A(c)）、GT 2粒子（B(c)）は200nm〜540nm、GT 3（C(c)）粒子は50nm〜300nmのサイズ領域に存在し最も小さいサイズであった。 このように，20K-P粒子はナノサイズに近い領域で存在し，生理活性成分の増強や抗酸化・抗菌作用を示すことが確認された。
FE-SEM micrographs of (a) 5K-P, (b) 10K-P and (c) 20K-P of GT 1 (A), GT 2 (B) and GT 3 (C), showing morphology and size of the extracted particles. 挿入図は、対応する粒子の光学顕微鏡写真を示す。
UV-Vis Spectrophotometry
図9は、それらのEGCG含有量について特徴付けられた抽出物と粒子のUV-Visスペクトルを示す。 Atomssa & Gotlap 201539は、カテキンファミリーの吸光度を報告している。 EGCGは、水中で248〜361nmの範囲の吸光度を示し、273.6nmにλmaxを有する；ECG 246〜363nmのλmaxは276.8nmである；水中のEGCのスペクトル範囲は254〜378nmであり269.6nmにλmax、ECのそれは252〜328nmで278.4nmにλmaxを有している。 図9（a）GT-1で観察されるように、273nmにEGCGの吸収ピークが見られるだけである。 EGCGのピークに関しては、抽出物（GT 0、5K-S、10K-S、20K-S）内で差は見られなかった。 しかし、緑茶粒子の場合、20K-P粒子は5K-P、10K-Pに比べ、EGCGの強度が著しく増加していることが観察された。 20K-Pは抽出物に含まれるEGCGのほぼ50％を保持していることが観察されたのは興味深い。
UV- 本研究で試験変数として使用した様々な緑茶成分の可視スペクトルです。
GT2の場合、図9（b）のこの範囲の様々なピークスパイクから観察されるように、抽出物は248〜363nmの範囲で他のカテキン族のピークの存在を示すことが確認された。 抽出物から粒子を除去することで、ピークにシフトが生じた。 特に抽出液は明確なシフトを示した。 しかし、粒子5K-Pと10K-Pの場合は、EGCGのピークのみを示し、強度も低いことが確認された。 ここで注目すべきは、20K-P粒子で、抽出物とほぼ同じ強度のカテキンピークが観測された。 5K-Pや10K-Pと異なり、20K-PはEGCGのピークだけでなく、他のカテキン系のピークも抽出物とほぼ同様であることが観察された。
GT 3 (Fig. 9 (c)) では、抽出物はカテキンピークを含む種々のピークが得られた。 しかし、GT1、GT2に比べ、5K-P、10K-P粒子自体が高い強度のEGCGピークを示した。 5K-P、10K-PがEGCGピークのみを示すという傾向は、GT3でも継続された。 5K-PはGT-1、GT-2に比べて高いEGCGを示したが、GT-3の10K-Pに比べるとかなり低い値であった。 GT3の10K-Pは、抽出物中のEGCG含有量とほぼ同じであった。 この場合、20K-Pは最も高いカテキンピークを記録し、抽出物をも凌駕していた。 20K-Pと抽出物の比較では、水抽出と溶媒抽出で報告されたピークシフトと同様のピークシフトが観察された。 20K-Pのピークは幅が狭く、強度が高いことが興味深い。 EGCに対応する269 nmの高いピークが20K-P’sで観察された。 2553>
FT-IR
最大の抗菌活性とユニークな特性を示したGT 3の粒子5K-P、10K-Pおよび20K-Pから得られたFT-IRスペクトルを図10（a）に示す。 このスペクトルは、EGCGの特徴的なバンドと一致する。 Ponnuraj et al, 201540は、EGCGのフィンガープリントは、芳香環に結合したO-H基が3357.46cm-1、トリヒドロキシベンゾエート基とクロマン基を結ぶC＝O基が1691.27cm-1と1616.06cm-1と強く、クロマン環に存在するC-H基が1447.31cm-1、1348.1cm-1にあると報告している。00 cm-1、O-C = O基が1222.65 cm-1、O-H基が1148.40 cm-1、クロマン環とトリヒドロキシ安息香酸環をつなぐC-O-C基が1041.37 cm-1、芳香環のC-H基は825.38 cm-1であった。 粒子径の減少に対応する遠心分離の増加の関数として、明確なパターンが観察されたことは興味深く、支持的であった。 5K-P では EGCG のバンドが最も低く、次いで 10K-P と 20K-P で高い強度のバンドが観察された。 これは、UV研究でも観察された結果と相関する。
(a) GT 3から分離した5K-P、10K-Pおよび20K-P粒子、（b） GT 1 の 5K-P および 20K-P および（c） GT-1 、 GT 2 および GT 3 から分離した 20K-P ナノ粒子のFT-IR 結果を示します。
図10（b）は、GT 1の5K-Pおよび20K-Pから得られたFT-IRスペクトルを示し、GT 1の場合、二つの粒子間のEGCGバンドにあまり差はなかった。 これらの結果は、UVspectrophotometric試験の場合にも観察されたものと一致する。 図10（c）は、GT 1、GT 2およびGT 3からの20K-Pの比較スペクトルを与える。 GT 1 < GT 2 < GT 3の順でEGCGバンドが増加する勾配パターンが明らかである
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