Amelogenin can be used for molecular sexing and evolutionary genetics in Cetartiodactyla
種特異的SC1-SC2プライマーによるアメロジェニン遺伝子座の研究セグメントの増幅により、すべてのCetaceaで明らかに性関連サイズ多型（図）が得られた。 1）。メスにはユニークな521 bpのバンド（2つのAmel-Xコピー）があり、オスにはさらにAmel-Yの980 bpのバンドがあることがわかった。 このパターンはヒゲクジラ（Mysticetes）のオスで明らかであったが、ヒトのアメロジェニン配列に由来するプライマーX5-X6を用いない限り、オスのイルカでは対応するアメロジェニンの増幅は見られなかった。 これまでの研究で、アメロゲニン増幅は対立遺伝子の脱落が起こりやすいこと、少なくとも優先的に増幅されることが示されていた。 これらの現象は、いくつかの要因によって説明できるかもしれない。 通常、ポリメラーゼの量が制限要因である場合や鋳型DNAが分解された場合には、サイズの小さい対立遺伝子の増幅が有利になる。 また、少量のDNAはアニーリングの確率を上げる可能性がある。 しかし、我々の結果はこのような状況とは一致しない。なぜなら、有利な対立遺伝子（Amel-Y）は常に最大のものであるからである。 一方、アニーリング配列のGC含量の違いやミスマッチが、増幅の違いを説明する可能性もある。 我々が調べたアメロゲニン断片は、X染色体から増幅された場合（56％）、Y染色体から増幅された場合（47％）よりGC含量が高いという特徴がある。 この違いは、Amel-X断片の非挿入に起因すると思われる。 この特徴に加えて、イルカのAmel-XとリバースプライマーSC2の5’末端との間にある2bp長のミスマッチ（図2）は、イルカではYコピーが優先的に増幅されることを支持していると考えられる（図1b）。 実際、SC2の代わりに雄イルカのSC3（ミスマッチのないプライマー、図2参照）を増幅すると、ヒゲクジラで見られた2本のバンドが復元された。
Sex-related size polymorphism of amelogenin fragment in Cetacean.All the Cetacean in Japan. (分子量マーカーはBiolabsの1kb+ラダー）：a）ヒゲクジラ（ラダーの左）とハクジラ（右）のオス増幅の違いを示すアガロースゲル。b）シマイルカのオスとメスの違いを示すアガロースゲル。 Amel-Yは1,000bpのバンド、Amel-Xは500bpのバンド。 各レーンは1つのサンプル（#1〜5）を表す。 7500>
Cetacea , Cattle and Manの標的配列とプライマーの配列アライメントを示したもの。 右側に種と染色体上の位置が示されている。 網掛けは、イルカで変異したヌクレオチドを示す。 配列のアクセッションナンバーは以下の通り。 イルカ (EMBL:AM744958-AM744964, EMBL:AM744970-AM744971, EMBL:AM744968, EMBL:AY787743S2 – Y and EMBL:AM744965 – X) とクジラ (EMBL:AM744967, EMBL:AM744969 -X- and EMBL.AM744965) の塩基配列がある。AM744966 – Y）、Cattle（GenBank:AB091789 -X- and GenBank:AB091790 – Y）、Man（GenBank:NT_011757 -X- from 9098117 to 9098612 and GenBank:NC_000024 -Y- from 6796200 to 6796719）である。
Y挿入位置のブレイクポイントを定義し、その進化史を調べるために、様々な鯨類の配列を決定した（方法論に記載；配列は以下のアクセッションで寄託されている）。 EMBL:AM744958〜AM744971に寄託されている）。 Artiodactylaの利用可能な配列（Methodsのリスト参照）とアラインメントした結果、ブタを除く他のCetartiodactylaに同じ多型を検出した（図3）：460-465 bpの挿入（サイズは異なる個体や種内のインデルの関数）第4エキソンと第5エキソンの間（Y配列例：EMBL:AM744958の第188から651番目の位置）に位置している。 ハプロタイプ名とそれに対応するアクセッションを表1に示す。 配列の類似性は、GenBank nr/nt nucleotide collection配列に対してBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)をmegablastアルゴリズム（高相似度配列を対象）で実行することにより確認された。 ウシとヒツジのAmel-Yに加え、唯一関連する2つのヒット（相同性78％と83％、E値4.10-68と3.10-53）がブタの第7染色体上の断片（約250bp）と一致し、挿入物はトランスポゾンの可能性があることが示唆された。
アメロゲニン座の性関連多型を進化の観点から概略図として示したもの。 挿入部とイントロン4は白い棒で表し、エクソン5は黒い棒で表す。 斜線はデータがないことを表し、進化的関係から推論している。 7500>
この挿入の存在は、ブタを除く鯨偶蹄目、およびおそらく他の初期派生グループ（ラクダ、カバ；図3参照）のシナポモフィー（共有特性）と解釈している。 この長い挿入の他に、46個のインデルが配列アラインメントによって検出された（位置と大きさの詳細は図5）。 インデルは、集団の情報ではなく、古代の分岐に関する情報を提供できるため、系統仮説を検証する上で特に有用である。 そこで、これらのインデルに含まれる情報を考慮した場合としない場合で、系統樹トポロジーに違いが出るかどうかを評価しました。 そこで、表1にまとめた鯨類の配列とArtiodactylaの配列を、まずギャップを欠損文字としてコード化した古典的な解析と、次にギャップを補足二文字としてコード化した解析を行った（図5参照）。 それぞれの解析で、2つの独立したベイズ検索が行われた。 図4に示す系統樹は、2回の検索間の標準偏差が0.01以下になった後にサンプリングされた2万本の樹木のコンセンサスから得られたものである。 図4の系統樹は、2回の実行の間の標準偏差が0.01以下になった後にサンプリングされた20,000本の木のコンセンサスから得られたもので、高い支持を得ているノードが示されている。 図4aに示すように、鯨偶蹄目（Stenella cœruleoalba, Balænoptera physalus, Grampus griseus, Tursiops truncatus, Bos taurus and Ovis aries）では性染色体コピーで分類されるが、他の哺乳類（Homo sapiens, Sus scrofa）ではAmel-XとAmel-YはCetartiodactyla由来のAmel-Xと一緒に分類されていることが確認された。 一方、挿入を考慮しない系統推定では、異なる結果が得られた（図4b）。鯨類ではハプロタイプも染色体ごとにクラスター化するが、他の鯨類では種の歴史や染色体の有無に関連したシグナルは見られなかった。 したがって、鯨偶蹄目から霊長類に向かうにつれて、種史に関連する系統学的シグナルが強まるようである。 このような系統的信号の部分的、均質的な持続性は、挿入部の周辺領域の影響によって説明できるかもしれない。 これは挿入が古かった（74-87年）結果かもしれない。 その後の相同性の喪失により，ある分類群（鯨類）では他の分類群（偶蹄目）よりも染色体間で乖離した進化が生じたのかもしれない。
Amel-XとAmel-Yフラグメントの推定した系統樹比較 (a)with the insertion (b) without the insertion. (a)完全な断片の系統樹はCetartiodactylaの性染色体によるトランス特異的なクラスタリングを示している。 先端ラベルはEMBLデータベースに寄託されているハプロタイプで、YはAmel-Y、XはAmel-Xのハプロタイプを表す。 Stenella cœruleoalbaのハプロタイプは集団の起源に従って命名した（YA/グループ1、YB/グループ2、Methods参照）。 (b) 挿入を除去した後の推定系統樹は、若干異なる様相を呈し、性染色体によるトランススペシフィックなクラスタリングが鯨類を除いて失われている。
調査した鯨類のAmel-XおよびAmel-Y領域の多型部位とインデルの比較。 (a)ヌクレオチド位置は上に、左側はハプロタイプの名称を表している。 最初の配列ですべての位置を表し、他のハプロタイプで一致するヌクレオチドはそれぞれドットで表している。 (b) インデルは、アラインされた配列上の順序に従って番号付けされている（1行目）。 インデルは位置（2行目）と長さ（3行目）によって特徴づけられている。 7500>
配列とインデルを組み合わせて、この領域をクレードレベルで研究することは興味深い。 これはCetartiodactylaの基底放射に関する多くの仮説（例えば）を検証するための手がかりを与えるだろう。 鯨偶蹄目系統の中で鯨偶蹄目（Suioidea）と鯨偶蹄目（Tylopoda）の位置が推定されることから（および図3）、挿入（矢印で示す図4a）で表される大きな進化イベントは、鯨偶蹄目-ルミナンチア群に一度起こり、残りの鯨偶蹄目に起こらなかったと仮定している。
進化の歴史はまた、我々の性決定技術が、鯨類に加えて、家畜と野生種を含む広範囲の鯨偶蹄類、特に広く分布する反芻動物（ウシ科、ヤギ科およびおそらくシカ科）に適用できることを示すものであった。
血統評価や集団遺伝学への応用
イルカでは、SC1-SC2プライマー対で増幅したAmel-Y断片は、Y染色体特異的に増幅されるので、クローニングの必要なく容易に配列決定が可能だった。 配列決定された10頭のシマイルカ試料から、9頭はオスであり、64の多型部位（塩基多様性π=0.004±0.0007）を有する7つの異なるYハプロタイプ（3頭で代表する1ハプロタイプと4個体のハプロタイプ）を推測することができた。 このうち半数は460bpの挿入部分にあった。 多型部位のアラインメントを図5(a)に示す。 驚くべきことに、これらの配列は2つの高度に分岐したハプログループを示し、平均49個の置換で分岐していた。 これは、地中海に2つの亜種が存在する可能性を支持する我々の結果と一致している（未発表データ）。 さらに、これらのハプログループのうち1つは24の情報提供部位を持つ高度な多型性を示したが、他のハプログループは8つしか示さなかった。 これらの値は、この種におけるミトコンドリアd-ループのY染色体対応として、血統解析や集団遺伝学に用いるには十分である。 実際、シマイルカでは、シマイルカとナガスクジラの配列間の平均塩基置換数は45であり、種内（群間）分岐は種間分岐よりも大きい。 2つのシマイルカ集団を比較すると、1部位あたり平均0.048±0.01の置換がある。 これは、それぞれの集団とコククジラの間で観察された分岐度（0.058±0.03）に匹敵し、塩基多様性は哺乳類のY染色体マーカーで観察される範囲（10-4）よりも1桁高いことが確認された。 ミトコンドリアのd-loopについては、増幅される断片の大きさによって、この手法の利用が若干制限される。 しかし、特に劣化したマッコウクジラのサンプルは増幅可能であった（データは示していない）。
Y染色体集団は有効サイズが小さいと考えられるので、遺伝的ドリフトの影響を受ける可能性が高い。 したがって、ボトルネック、拡大、創始者効果など、より最近の人口動態のイベントを反映している 。 このような事象を研究するためには、曖昧さが少なく、かつ組換えが樹木の独自性を妨げない領域で遺伝子の系譜を再構成できるような、多様性の高いマーカーが必要である。 この目的のためには、多様性の高いマイクロサテライトは貴重なマーカーであるが、状態によって同一であり、血統によって同一ではない対立遺伝子（ホモプラス）から生じる樹木の不確実性を考慮するために、集中的な計算方法が必要である。 したがって、新しい配列マーカーを追加することは、鯨偶蹄目におけるY染色体集団遺伝学にとって興味深いことである。 さらに、図4の両木の各辺における突然変異率のベイズ推定値は、系統推論と共同で計算され、核DNAのマーカーとしては高い値を示している：Cetartiodactylaのすべての枝で1年当たり10-8から10-10の部位置換である。 この値は哺乳類のミトコンドリアdループと核DNAの値の中間である。
Functional perspectives in amelogenin evolution
我々は調査した4種の鯨類のアメロゲニンのすべてのY染色体コピーでエクソン5のアミノ酸位置98と99に2つの停止コドンを見つけた（配列EMBL：AM744959の988〜993の位置）。 したがって，Amel-Y遺伝子産物は，これらの種では切断されているか，他のほとんどの真獣類群の種ですでに観察されているように偽遺伝子を表している可能性がある
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