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＜5488＞S・プルプラタスは人工海水で14℃の環境下で飼育した． L. anatinaは2016年6月に台湾新竹市香山区香山湿地（GPS座標 24.770779, 120.910742 E）で採集し、氷上で実験室に輸送した後、直ちに解剖した。
構築物とプラスミド
SPAIDLとLaAIDLの酵素活性を決定するために、SPAIDL1、2、3、4a、9、LaAIDL1、2およびHsAIDのそれぞれの細菌発現ベクターpASK-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAIDが生成された。 各SpAIDLのオープンリーディングフレームは、Phusion polymeraseとSpeIおよびXhoI制限部位を含むプライマーを用いたPCRによってゲノムDNAから増幅した（補足表1）。 PCR産物をSpeIおよびXhoI（New England Biolabs）で消化し、TadAオープンリーディングフレームに代えてpASK-TadA（Nina Papavasiliou博士、Rockefeller University, New Yorkからの贈り物）のNheI/XhoI部位に挿入した。 SpAIDL9では、このクローニング戦略により3番目のアミノ酸がフェニルアラニンからセリンに変更され、このF3S変異はQuikchange変異誘発キット（Stratagene）を用いてSPA9S3FT/SPA9S3FBプライマーでF3へ戻した（補足表1）。 HsAIDは、ヒト全長AIDを含むプラスミド（pCDF-AID、Nina Papavasiliou博士、Rockefeller University, New Yorkからの贈り物）から増幅された。 クローニング戦略により、2番目のアミノ酸をアスパラギン酸からアラニンに変更し、プライマーhAIDA2DT/hAIDA2DBを用いてQuikchange mutagenesis kit (Stratagene) によりD2AをD2へ戻した（補足表1）。 空のpASKは、pASK-TadAのNheI/XhoI消化、Klenowポリメラーゼによるオーバーハングの充填、T4 DNAリガーゼ（Thermo Scientific）によるライゲーションにより作製した。 各LaAIDLのオープンリーディングフレームはL. anatina cDNAから増幅し、pJET1.2/blunt cloning vector (Thermo Scientific)にクローン化した。 LaAIDLXオープンリーディングフレームをSpeIとXhoI（New England Biolabs）で切り出し、SpAID4aインサートに代えてpASK_V5-SpAID4a（後述）のXbaI/XhoI部位にクローン化した。 クローン化された断片は、発現されたタンパク質がV5タグを含まないように、その3′末端に元の停止コドンを含むことに留意されたい。
SPAIDL1およびLaAIDL1の活性部位変異体（SPAIDL1 H86R E88Q, SpAIDL1 H86R E88Q C123A C126A, LaAIDL1 H81R E83Q H298R E300Q）は、Quikchange mutagenesis kit (SpA1H85RE87QT/SPA1H85RE87QB for SpAIDL1 RQ) を用いてそれぞれの野生型（または単一変異体）プラスミドから部位特異的変異誘発により生成させた。 または5′-リン酸化プライマー（SPA1CCAA-P/SPA1CCAABはSPAIDL1 RQAAにおける2番目の改変、LaA1H81RE83QB/LaA1H81RE83Q-PとLaA1H298RE300QB/LaA1H298RE300Q-PはSPLaAIDL1 RQRQ）を用いた通常のPCRにより、DpnI消化、生成物を環化するライゲーションを経てコンピテントE.に変換。 pASK_V5は、V5タグ配列を含むオリゴヌクレオチドpASK_V5F/pASK_V5R（補足表1）をアニールし、pASK-TadAのNheI/SalI部位にライゲーションすることにより作製された。 pASK-SpAIDLX/LaAIDLXプラスミドを鋳型として、Phusionポリメラーゼと補足表1に示したプライマーを用いて、ストップコドンなしのそれぞれのcDNAを増幅し、pASK_V5のNheI/XhoIサイト（SPAIDLXおよびHsAID断片用）またはXbaI/XhoIサイト（LaAIDLX断片用）へクローニングを行った。 HsAIDはpASK-hAIDから増幅した。 SpAIDL9とHsAIDの配列は、このクローニング戦略によって再び変化したが、上記のように正しい配列に戻した。
ゲノムDNA調製
S. purpuratus と L. anatinaの両方のゲノムDNAは、gDNA Spin Kit Tissue (Bioman) を用いて製造者の説明書に従って精製された。 S. purpuratusの珪藻球とL. anatinaの組織100 mgを別々のマイクロチューブに加え、200 mgのProteinase Kを含む200 µl buffer GT (Bioman) で均質化し、60℃で30分間インキュベートして細胞を完全に溶解させた。 200 µl BG buffer (Bioman)を加えた後、ボルテックスし、70 °Cで20分間インキュベートした。 その後、200 µlのエタノールを加え、サンプル全体をGDスピンカラム（Bioman社製）にロードした。 10,000×g、30秒間の遠心分離により、400μlのWIバッファ（Bioman）、600μlの洗浄バッファで洗浄を行い、60℃に予熱した100μlの溶出バッファ（10 mM Tris pH = 8.0）でゲノムDNAを溶出させた。
RNA調製とcDNA合成
S. purpuratusの骨髄液を注射器で骨膜から抜き取り、直ちに等量のCMSFW-EI (0.53 M NaCl, 10 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 11 mM Na2SO4, 30 mM EDTA, 50 mM Imidazole) と混合した。 珪藻球をスピンダウンし、800 μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman)に再懸濁した。 S. purpuratusの食道、小腸、大腸、生殖腺、L. anatinaの脚部、消化盲腸、生殖腺、腸を個体から剥離した。 S. purpuratusとL. anatinaの固形組織の小片を200μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman) に加え、0.5mm ZrOビーズを用いてBullet Blender (Next Advance) でホモジナイズし、試料を調製した。 不溶性デブリをスピンダウンし、上清を600μl EasyPure Total RNA Reagent（Bioman）および担体として200μgグリコーゲンを含む新しいチューブに移した。 その後、製造業者のプロトコルにしたがってTotal RNAを精製した。 残存するgDNAやその他の夾雑物を除去するために、S. purpuratus RNAをTurbo DNA-free kit (Ambion) またはRNeasy mini kit (Qiagen) のいずれかを用いてさらに処理した。 Turbo DNA-free kit (Ambion) は、DNase 消化のために MgCl2 (2.5 mM) と CaCl2 (1 mM) を追加した以外は、製造元のプロトコールに従って使用された。 RNeasy mini kit (Qiagen) をメーカーのプロトコールに従って使用した。
S. purpuratus と L. anatina の各組織からの約250-500 ngのRNAをそれぞれ ThermoScript RT-PCR System (Invitrogen) または ToolsQuant II Fast RT Kit (Biotools) でcDNAに変換した。 どちらの場合もランダムヘキサマーを使用し、製造者の指示に従った。
cDNA末端の迅速増幅
SPAIDL9転写物の5′および3′末端は、SMARTer RACEキット（Clontech）と遺伝子特異プライマーSPA9CR1、SPA9CR2、SPA9CF1、SPA9CF2（補足表2参照）を用いて製造者の説明書に従って増幅された。 転写産物の5′および3′末端を含むPCR産物をpJET1.2/blunt cloning vector (Thermo Scientific)にクローニングし、個々のクローンの塩基配列を完全に決定した。 SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9のオープンリーディングフレームをPhusionポリメラーゼと表2に示したプライマーを用いて増幅した。 PCR産物はpJET1.2/blunt cloning vector (Thermo Scientific)にクローニングした。 プラスミドはTools mini plasmid kit (Biotools)を用いて精製し、pJET1.2 forwardまたはpJET1.2 reverse primersを用いて配列決定のために商業サービス（Genomics Taiwan）に提出した
それぞれの遺伝子について少なくとも8配列が各ウニから集められ、プライマー配列は配列調整の前に排除された。 各遺伝子の塩基配列は、まずCLUSTALW (www.genome.jp/tools/clustalw) を用いてS. purpuratus内で整列させ、その後、個々のウニ間で比較するために2つの対立遺伝子に対応する優性配列を選択した。
遺伝子発現解析
S. purpuratus3個体（Sp146, Sp147, Sp148）およびL. anatina2個体（La1およびLa3）の相補DNAをテンプレートとして、SPAIDL1、2、3、4a、9またはLaAIDL1、2について定量PCR法により発現解析を実施した。 各qPCR反応（10μl）には、5μl Fast SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）、プライマー（0.1μM）（補足表3参照）および1μlの鋳型を含み、各サンプルについて2つの技術的複製を設定した。 qPCR 反応は 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) で行い、95 ℃で 20 秒間の初期変性ステップと、95 ℃で 3 秒間、60 ℃で 30 秒間の 40 サイクルを適用した。 5250>
細菌感染モデル
Vibrio diazotrophicusをDifco marine broth (Becton Dickinson) 液体培地で30℃、250 rpmで一晩培養した。 健康なウニ6個を無作為に選び、実験群と対照群の2群に分けた。 実験群のウニには、200μlの滅菌人工海水中の生きたVibrio diazotrophicusの懸濁液を、全骨髄液量106個/mlに相当するように各ウニに菌量を調整して注入し、t = 0で各動物から骨髄液のアリコート（0.5 ml）を採取した。 対照群には200 µlの滅菌海水を注入した。 t = 6, 24, 48 時間に、各群の各動物から 200 µl の腸液を採取した。 各時点で得られた骨髄液からRNAを抽出し、t = 0のサンプルからはゲノムDNAも調製した。 遺伝子発現解析用のプライマー対（補足表3）は、まずゲノムDNAサンプルでテストし、S. purpuratus集団内でその配列に顕著な多型レベルがあるにもかかわらず、各個体からそれぞれの遺伝子を増幅できることを確認した（図1bを参照）。 定量的RT-PCR（上述）を用いて、サンプルあたり少なくとも2つの技術的複製で、遺伝子発現レベルを測定した。 発現値は、まず各サンプルの18Sレベルで正規化し、次に各動物のt = 0での値で正規化した。 5250>
CDA assays with kanamycin resistance reporter
Asay of a widely used to measure polynucleotide CDA activities26 を最適化したプロトコルを使用した。 KanR遺伝子にL94P点変異を導入したpTAC-Kanデアミナーゼレポータープラスミドと個々のpASK-SpAIDLX/LaAIDLX発現ベクターをUNG欠損BH156大腸菌に順次形質転換させた。 ヒトAID発現ベクターpASK-HsAIDおよび空pASKベクターは、それぞれポジティブおよびネガティブコントロールとして機能した。 デアミナーゼアッセイのために、各推定デアミナーゼについて少なくとも8個の個々のコロニーをLBブロス（50μg/mlのアンピシリン（Amp）、50μg/mlのスペクチノマイシン（Spc）および17μg/mlのクロラムフェニコール（Cam）含有）中で600nmでの光学密度が0.3になるまで生育させた。 その後、各培養物を半分に分割した。 IPTG（1mM）を両方に加える一方、アンヒドロテトラサイクリン（AHT）（0.2μg/ml）を一方にのみ加え、SpAIDLX/LaAIDLXの発現を誘導した。 37℃、200rpmで3時間培養した後、培養物をスピンダウンし、PBSで洗浄し、Amp 50μg/ml、Spc 50μg/ml、Cam 17μg/ml、またはAmp 50μg/ml、Spc 50μg/ml、Cam 17μg/ml、カナマイシン (Kan) 30μg/mlを含むLBプレート上に撒いた。 復帰頻度は、Amp+Spc+Camプレート上のコロニー総数に対するKanRコロニー数の比率として算出した。 次に、相対的復帰頻度は、デアミナーゼ発現の有無にかかわらずIPTGでKanR転写を誘導した1組の同一細菌培養からの復帰頻度の比として決定された。 KanRコロニーが本当にDNA脱アミノ化の結果であることを確認するために、複数のコロニーからのpTAC-Kanプラスミドを精製し、停止コドンの復帰をDNA配列決定により確認した。
レポーターとしてrpoBを用いるCDAアッセイ
ポリヌクレオチドCDA活性35の測定に広く用いられているアセイの最適化プロトコルが使用された。 無脊椎動物デアミナーゼの個々のpASK発現ベクターを、UDG欠損のBH156大腸菌に別々に形質転換させた。 100 μg/ml Amp、17 μg/ml Cam、および0.3 μg/ml AHTを含むLB培地の4 ml培養物に、単一細菌コロニーを接種した。 培養物を37℃230rpmで24時間培養し，アリコートを100μg/ml Ampまたは100μg/mlリファンピシンを含むLB寒天培地にプレーティングし，37℃にて一晩培養した。 コロニーを数え、復帰頻度は同一培養物からのAmpRコロニー数に対するRifRコロニー数の比として算出した。 HsAIDを発現する培養物、または空のpASK発現ベクターを含む培養物をそれぞれ陽性および陰性対照とした。 各発現コンストラクトにつき少なくとも8つの培養物を試験した。 リファンピシン耐性コロニーからのrpoB遺伝子の変異の同一性を決定するために、24個の個々のコロニーからPhusionポリメラーゼとrpoBF/rpoBRプライマー対を使用してコロニーPCRを行った。 PCR産物はゲル精製し、rpoBFプライマーを用いて塩基配列を決定した。 変異はWT配列（Genbank acc. CP024859.1, nt 2321219-2321797）と比較して同定した。
Protein expression of invertebrate deaminases in E. coli
SpAIDLX/LaAIDLXの発現量をdeaminase assayでモニターするために、pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLXはUNG欠損BH156にトランスフォームさせた。 個々のコロニーをLBブロス（50μg/mlのAmp、50μg/mlのSpc、および17μg/mlのCamを含む）中で600nmにおける光学密度が0.3になるまで増殖させた。 IPTG（1mM）およびAHT 0.2（μg/ml）を培養物に添加し、タンパク質発現を誘導した。 3時間インキュベートした後（37℃、200rpm）、培養物をペレット化し、PBSで洗浄した。 ペレットを2x SDSサンプルバッファーで溶解し、10倍に希釈し、一対の10% SDS-PAGEゲルで分離した。 一方のゲルをクマシーブルーで染色し、等量のタンパク質がロードされたかどうかを評価する一方、もう一方のゲルをセミドライトランスファーによりPVDF膜に転写し、マウス抗V5一次抗体（Abcam、ab27671）および西洋わさびペルオキシダーゼ結合ウサギ-抗マウス二次抗血清（Jackson ImmunoReasearch）を用いてV5-タグ付デアミナーゼが検出された。 化学発光シグナルは、Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) と X 線フィルムまたは ChemiDoc Touch (BioRad) イメージングシステムを使用して可視化した。 すべての染色タンパク質ゲルおよびウェスタンブロットの非切抜き画像を補足図5に示す。 すべての細菌発現実験は二重に行った。
Bioinformatics
ウニゲノムとの配列比較は、BLAST、BLASTP、BLASTNを用いて、https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi または www.echinobase.org で標準パラメータまたは低複雑度フィルターをオフのいずれかにして行った。 複数配列のアラインメントはCLUSTALWを用いて行い、予測される二次構造の特徴に基づき手動で最適化した。 5250>
Data availability
本研究の結果を支持する配列データは、以下のアクセッションコードでGenbankに寄託されている。 SpAIDL1 (MH106904, MH106887, MH106888, MH106889, MH106890, MH106891), SpAIDL2 (MH048921, MH048922, MH048923, MH048924, MH048925), SpAIDL3 (MH106892, MH106893, MH106894, MH106895, MH106896, MH106897), SpAIDL4a (MH106905, MH080287, MH080288, MH080289, MH080290), SpAIDL9 (KY241384, KY241385, MH106898, MH106899, MH106900, MH106901, MH106902, MH106903), LaAIDL1 (MH106906), LaAIDL2 (MH106907).