Albino Ratsの高血圧治療における抗酸化ミネラル元素の投与効果

Abstract

酸化ストレスは、高血圧、動脈硬化、糖尿病、慢性腎臓病などのさまざまな病態に関与している。 本研究では，Wistarラットを用いて，抗酸化物質である銅，マンガン，亜鉛の高血圧治療における可能性を検討することを目的とした。 ラットに8％NaCl食を5週間与え、さらに4週間、挑戦的な薬剤の存在下でサプリメントを投与した。 高血圧コントロールと比較して、サプリメントの投与は血圧を有意に低下させた。 また、高血圧コントロールと比較して、総コレステロール、トリグリセリド、低密度リポタンパク質コレステロール、超低密度リポタンパク質コレステロール、マロンジアルデヒド、インスリン、高密度リポタンパク質コレステロール、総合抗酸化活性、一酸化窒素のレベルが有意に減少したことが示唆された。 アテローム形成に対する平均的な保護率は、すべての補充群で47.13 ± 9.60%であった。 平均動脈血圧は、グルコース、総コレステロール、トリグリセリド、低密度リポタンパク質コレステロール、超低密度リポタンパク質コレステロール、アテローム性指数、インスリン抵抗性およびマロンジアルデヒドと有意な正の相関を示し、高密度リポタンパク質コレステロールおよび総抗酸化活性は負の相関を示しました。 この結果は、酸化ストレスと高血圧の強い関係を示し、高血圧に関連する酸化ストレス、脂質異常症、インスリン抵抗性を軽減する抗酸化ミネラルの役割を強調するものであった。 はじめに

高血圧は世界中で最も一般的な疾患の一つであり、心血管障害による死亡の主な原因である。 高血圧は罹患率および死亡率に関連するため、公衆衛生上の問題であり、したがって、適切な予防および管理戦略を模索する必要性は、医療従事者の関心事であるべきである。 血管の酸化ストレスの増加は、先進国および発展途上国における心血管疾患および死亡の主要な危険因子である高血圧の発症に関与している可能性がある。 高血圧の発症は、遺伝的素因と環境要因の複雑な相互作用によって引き起こされる。 食塩摂取量の増加は、血圧の上昇とそれに伴う末端臓器障害の発生を悪化させる可能性がある。

内皮機能障害、酸化ストレスの増加、抗酸化活性の低下など、血管系の構造的・機能的異常が高血圧に先行して発症に寄与しているという新しい概念が、近年支持されるようになってきた 。 動物実験では、血圧の上昇は酸化ストレスの上昇と関連しているという仮説が一般的に支持されている . 高血圧患者では、脂質過酸化副産物の上昇と抗酸化システムの活性低下が報告されている。 いくつかの研究では、高血圧におけるレベルの上昇を示し、過剰の原因としてNADPHオキシダーゼが関与しているとされています。

Angiotensin IIは、血管平滑筋、内皮細胞、心筋細胞におけるNADPHオキシダーゼ活性の強力な活性剤であると示されています . 高血圧、糖尿病、メタボリックシンドロームに共通する所見は内皮機能障害であり、血管拡張薬と血管収縮薬の発現と感受性のアンバランスによって血管緊張が高まり、その結果、流れに対する抵抗が増加することが特徴である …

銅、マンガン、亜鉛は一般に抗酸化ミネラルと呼ばれ、いくつかの抗酸化酵素の活性に必要とされる。 弘之らは、亜鉛の欠乏が高血圧による酸化ストレスを介して遺伝的高血圧の発症に重要な役割を果たす可能性があることを報告した。 スーパーオキシドアニオンは、内皮由来の血管拡張物質である一酸化窒素を速やかに不活性化し、血管収縮を促進することが知られています。 そのため、活性酸素の高血圧作用に対抗する試みとして、外因性の抗酸化物質が動物モデルやヒトの高血圧症において血管機能を改善し、血圧を低下させるために使用されている . したがって、高血圧の管理における抗酸化物質の銅、マンガン、亜鉛の潜在的な効果の評価は、この研究の基礎となるものである。

2.方法

2.1. 化学物質と試薬

この研究には、分析的に等級付けされた化学物質と試薬が使用された。 硫酸銅と硫酸マンガンはイギリスのMay and Baker社から、硫酸亜鉛はニュージャージー州PhilipsburgのJ.T. Baker chemical companyから調達した

2.2. 実験動物

体重150-180gのオスWistarラットをナイジェリア、ソコトのUsmanu Danfodiyo University、獣医学部から購入し、実験開始前に2週間馴化させた。 動物は5匹ずつ6つのグループに分けられ、実験期間中、ペレット化した育成用飼料（Vital feed, Jos, Nigeria）を与え、自由に水を飲めるようにした。 実験プロトコルは、Usmanu Danfodiyo University, Sokoto, Nigeriaの倫理委員会によって承認された

2.3. 高血圧の誘発

ラットは、飼料に8％のNaClを加えることで正常血圧のコントロールを除いて、高塩分飼料（8％NaCl）で9週間飼育された。 塩分負荷6週目から治療を開始した。

2.4. 血圧の測定

血圧は、非侵襲的なUgo Basile, series 58500 Blood Pressure Recorderを用いて、毎週テールカフ法でモニターされた。 各ラットについて4回の測定値の平均をとり、測定期間中、ラットの体温をモニターした。 平均動脈圧は以下の式に従って算出した：ここで、SPとDPはそれぞれ収縮期と拡張期の血圧である

2.5. サプリメントの調製

硫酸銅、硫酸マンガン、硫酸亜鉛を蒸留水に溶解し、それぞれ銅2.5mg/mL、マンガン2.4mg/mL、亜鉛11mg/mLを調製した。 いずれのサプリメントも投与直前に調製した

2.6. 動物のグループ分けと処置

グループI 正常な未処置/蒸留水。 グループII 高血圧コントロール/蒸留水。 Group III 銅4mg/kgで塩分負荷処理したもの。 Group IV マンガン10 mg/kgで塩分負荷処理したもの。 グループV 亜鉛20 mg/kgで塩分負荷処理。 VI群 銅4mg/kg、マンガン10mg/kg、亜鉛20mg/kgを塩蔵したもの＜1715＞＜6247＞サプリメントの濃度は、推奨食事量に基づいて選択し、適切な量を投与群の体重に応じて静脈内カニューレ管を用いて4週間経皮投与した。 最後の投与から24時間後、動物をクロロホルム蒸気で麻酔し、生化学的分析のために心臓穿刺により空腹時血液サンプルをラベル付きチューブに採取した。 実験期間中、ラットの体重の変化をモニターした。

2.7. 生化学的パラメータの推定

血液サンプルを凝固させ、4000gで10分間遠心分離し、得られた血清は、グルコース、脂質プロファイル、総抗酸化状態、インスリン、スーパーオキシドディスムターゼ、カタラーゼ、一酸化窒素の推定に使用された。 動物を犠牲にし、各ラットの肝臓を解剖し、氷冷生理食塩水で洗浄し、血液を除去した。 氷冷した0.1 M Tris buffer, pH 7.4で10%ホモジネートを調製し、ホモジナイザーを使用した。 このホモジネートを4000 gで15分間遠心分離した。 上清はチオバルビツール酸反応物質（TBARS）とグルタチオンペルオキシダーゼ活性の推定に使用された。 血清総コレステロール、トリグリセリド、高密度リポ蛋白コレステロールは酵素法で測定した。

血清低密度リポ蛋白コレステロールと超低密度リポ蛋白コレステロールはfriedewaldらの式で算出した． 血清の総抗酸化状態および組織のマロンジアルデヒドの推定には比色法が用いられた．

SODの推定にはCayman’s Superoxide Dismutase Assay Kitが使用されました。 このアッセイは、キサンチンオキシダーゼとヒポキサンチンによって生成されたスーパーオキシドラジカルを450 nmで検出するためにテトラゾリウム塩を利用する。 SODの1単位は、スーパーオキシドラジカルの50% dismutationを示すのに必要な酵素量と定義される。

カタラーゼ活性は、Caymanのカタラーゼアッセイキットを用いて推定された。 この方法は、最適濃度のH2O2の存在下で酵素をメタノールと反応させることに基づいている。 生成したホルムアルデヒドは、4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole (Purpald) を発色剤として540 nmで測定される。

グルタチオンペルオキシダーゼ活性は、Cayman’s Assay Kitを用いてアッセイした。 このアッセイは、グルタチオンレダクターゼとのカップリング反応により間接的にグルタチオンペルオキシダーゼ活性を測定するものである。 グルタチオンペルオキシダーゼによるヒドロペルオキシドの還元により生成した酸化グルタチオンは、グルタチオンリダクターゼとNADPHにより還元状態にリサイクルされます。 NADPHのNADP+への酸化は340 nmの吸光度の減少を伴います。

一酸化窒素はCaymanのAssay Kitで見積もられました。 このアッセイは、簡単な2段階のプロセスで総硝酸塩/亜硝酸塩濃度を正確かつ簡便に測定する方法です。 まず、硝酸還元酵素により硝酸塩を亜硝酸塩に変換します。 第二段階は、亜硝酸塩を濃い紫色のアゾ化合物に変換するGriess試薬の添加です。

インスリンはSPI biorat insulin enzyme immunoassay kitによって推定されました。 このアッセイは、非標識ラットインスリンとラットインスリン（トレーサー）に結合したアセチルコリンエステラーゼが、限られた特異的モルモット抗ラットインスリン抗血清サイトをめぐる競合に基づくもので、ラットインスリンを測定するためには、ラットインスリン抗血清サイトとアセチルコリンエステラーゼが必要です。 その後、プレートを洗浄し、エルマン試薬をウェルに添加し、アセチルコリンエステラーゼトレーサーがエルマン試薬に作用して黄色の化合物を形成し、405nmで測定された。

Homeostasis Model Assessment-Insulin Resistance (HOMA-IR) により、インスリン抵抗性指数を算出した。 アテローム形成に対する保護率は、以下の式

2.8 を用いて算出した。 統計解析

数値は各群5匹のラットの平均標準偏差で表した。 結果は、GraphPad Instatソフトウェアを用いて、一元配置分散分析（ANOVA）、それに続くDunnettの多重比較検定を用いて統計的に分析された。 結果

ラットの体重増加（図1）は、食塩無投与のコントロールが処理群および正常血圧のコントロールよりも体重増加（）が大きいことを示した。 サプリメントは高血圧コントロールと比較して、ラットの体重変化に有意な()効果を示した。

塩負荷ラットの平均動脈血圧が有意（ ）に上昇していた（図 2）。 サプリメント投与により、高血圧コントロールに対して、投与群の平均動脈血圧は有意に低下した。

図2

食塩負荷により血清グルコース、インスリン、インスリン抵抗性が有意に上昇し（表1）、ミネラル元素の補充によりその傾向が逆転した。

血清脂質プロファイルおよびアテローム性指数に対する補給の効果は表2に示すとおりです。 その結果，食塩無添加群と比較して，TC，TG，LDL-C，VLDL-C，AIが有意に減少し，HDL-Cが増加した．

脂質プロファイルとアテローム指数に対する抗酸化ミネラルの効果。

アテローム形成に対する保護率（図4）は、銅、マンガン、亜鉛のグループと比較して、ミネラルを組み合わせて補給したグループの保護率が有意に（）増加することが示された。 ミネラル併用群は60.79%と最も高い保護率を示し、マンガン併用群は38.76%と最も低い保護率を示した。

Effect of supplementation on total antioxidant status, nitric oxide, and MDA (Table 3) was recognized increase in levels among untreated group and manganese () and mineral combined () groups. また、無処置の対照群に比べ、補充群の組織MDAは有意に（）減少したことが示された。 内皮機能もまた、補給後に改善された。

抗酸化酵素に対する補給の影響の結果を表4で示す． その結果、高血圧コントロールと比較して、サプリメントの摂取はcat、Gpx、SODの活性を増加させることが示された。

MABPとグルコース、インスリン耐性、脂質プロファイル、酸化ストレスマーカーとの相関係数（）は図5に示した。 その結果、MABPとグルコース、インスリン、インスリン抵抗性、TC、TG、LDL-C、VLDL-C、AI、MDAは有意な正の相関を示し、HDL-C、TAS、SOD、Cat、GPxはMABPと負の相関を示していた。

4.考察

高血圧は心血管疾患の最も上位の危険因子の一つである。 このモデルでは、Wistarラットに8%のNaClを含む食餌を5週間、さらに4週間の食塩負荷食を与えて高血圧を誘発させた。 高塩分はラットに高血圧を引き起こすことが報告されている 。 高塩分食が高血圧を誘発するメカニズムは、循環ナトリウムレベルが上昇し、浸透圧のために細胞が水分を放出し、血管壁にかかる圧力が上昇するためと考えられる。 その他のメカニズムとしては、血管平滑筋のナトリウム-カルシウム交換ポンプを阻害することによって血圧を上昇させるアデノシン三リン酸分解酵素を阻害する血漿の能力の増加、またはナトリウム食は腎臓の血管収縮とNADPH酸化酵素の活性化による腎臓の生産増加をもたらすかもしれない腎臓内アンジオテンシンII増加と関連している可能性がある。 NADPH オキシダーゼの活性化によるスーパーオキサイドアニオンなどのフリーラジカルの過剰生成は、抗酸化力を圧倒し、酸化力と抗酸化力のバランスが崩れ、酸化ストレスとなる可能性がある。 その結果、食塩負荷によりラットの動脈血圧が上昇し、抗酸化ミネラルの補給により血圧の上昇を抑制することが示された。 この結果は、Sprague-Dawley ラットやWistar ラットなど様々な系統のラットに食塩を負荷すると血圧が上昇するという報告を確認するものである。

ミネラルを複合的に補給した群では、平均動脈血圧がほぼ正常化したことから、抗酸化ミネラルの単独補給よりも複合療法の方が血圧低下に効果があるようだ。

このモデルにおける銅、マンガン、亜鉛の血圧低下効果は、スーパーオキシドアニオンによる一酸化窒素の消光を減少させるフリーラジカル消去特性、NADPH酸化酵素活性の減少、またはスーパーオキシドディスムターゼの必須かつ不可欠の部分を形成するのでスーパーオキシドディスムターゼ活性の増加によるものと思われます。 今回の結果は、亜鉛の補給が食塩負荷高血圧ラットの血圧を下げるという報告を裏付けるものである。

高血圧ラットで観察されたトリグリセリド、総コレステロール、低密度リポタンパク質コレステロール、超低密度リポタンパク質コレステロールのレベルの増加と高密度リポタンパク質コレステロールの減少は、補充したグループと比較していくつかの研究で裏付けられました。 本研究におけるHDL-Cの増加、LDL-Cの減少と高血圧の心血管系転帰との関係の基礎にある可能なメカニズムは、LDL粒子内の酸化脂質種を減らし、それによって動脈硬化から保護するHDL-Cの合成増加または分解減少によるものである可能性がある。 これはまさに動脈硬化に対する保護の出発点を反映しているのかもしれない。 また、高血圧コントロール群と比較して、グルコース、インスリン、インスリン抵抗性、マロンジアルデヒドの値が減少し、一酸化窒素の値が増加した。 サプリメント摂取群で観察された内皮機能とインスリン感受性の改善は、高血圧の管理における抗酸化物質の銅、マンガン、亜鉛の役割を確認するものである。 したがって、インスリン感受性と内皮機能に対するこれらのミネラルの抗酸化作用の基礎となる正確な分子メカニズムは、このモデルでは完全に決定されていないが、脂質過酸化指数、マロンジアルデヒドのレベルの低下と内皮機能の測定である一酸化窒素の増加によって示されるように、抗酸化状態と内皮機能の改善をもたらす酸化ストレス抑制を介したものである可能性がある。

本研究の結果は、食塩負荷がラットの脂質過酸化を誘発し、抗酸化酵素の活性に影響を与えることから、酸化ストレスを介して高血圧を誘発することを示唆している。 このことは、食塩によって引き起こされた酸化ストレスによって圧倒された抗酸化ミネラルの補給後の総抗酸化状態およびスーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼの活性の増加によって示された。

これらの変数間の関連度を決定するために、平均動脈血圧と我々のモデルで評価したすべての生化学パラメータを関連づける試みも行われた。 その結果、平均動脈圧とグルコース、総コレステロール、トリグリセリド、低密度リポ蛋白コレステロール、超低密度リポ蛋白コレステロール、アテローム性指数、インスリン抵抗性、マロンジアルデヒドは有意な正の相関を示し、高密度リポ蛋白コレステロール、総合抗酸化状態、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、グルタチオンパーオキシダーゼは有意な負の相関を示すことが明らかとなった。

MABPとマロンジアルデヒドの正の相関は、血圧の上昇によりチオバルビツール酸反応物質がより多く生成され、サプリメントはMABPとMDAの両方を減少させることが示唆された。 MABPと総抗酸化状態、カタラーゼ、SOD、グルタチオンペルオキシダーゼとの負の相関は、MABPの増加がこれらの酵素の活性を低下させ、過剰なフリーラジカルの生成に起因するTASを減少させた証拠であるが、サプリメントはその影響を改善する。

これらの観察は、高血圧における酸化ストレスの役割をさらに確認し、抗酸化ミネラルの補充は、我々の結果が抗酸化保護を提供するので、高血圧の心血管合併症を防止または遅延する可能性がある。 ただし、活性酸素の増加が高血圧の結果なのか、そうでないのかは不明である

5. 結論

この結果は、高血圧における酸化ストレスの役割を確認し、高血圧の心血管合併症の遅延と治療における銅、マンガン、亜鉛の役割を強調した

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