May 12, 2018
抗体ベースのアッセイからシグナルを得たときに、科学者が常に尋ねる共通の質問が1つあります。 “このシグナルは本当に私のタンパク質の存在と量を表していますか？”
抗体の特異性は、科学者にとって常に懸念されることです。 特異性テストに使用されている多くの検証方法があるにもかかわらず、そのデータはしばしば過剰に解釈されます。 様々なグループの研究データから、市場で広く使われているモノクローナル抗体の中には、実はモノクローナル抗体でないものがあることが分かっています。 そのため、抗体の特異性を検証するために、どのような対照を用いるべきでしょうか。
抗体検証のための陽性対照として、標的タンパク質を大量に発現している細胞株や組織を用いることが可能です。 ただし、陽性対照は抗体の特異性を確認することはできません。 しかし、陽性コントロールでは抗体の特異性を確認することはできません。正しいサイズのバンドが見えたり、正しい細胞内位置で陽性染色が見られたりしますが、それらはすべて抗体の交差反応による偽陽性シグナルである可能性があります。 そのため、通常、抗体バリデーションでは、非特異的結合を評価するためのネガティブコントロールが必要です。
ノックアウトバリデーションは、抗体の特異性を評価するための最良のネガティブコントロールと言えます。 ノックアウトバリデーションでは、標的タンパク質を発現していないノックアウト細胞株で抗体をテストします。 2017年から、OriGeneはCRISPRイノベーターであるEdiGeneと提携し、ハイスループットでダブルノックアウトセルを作製することに成功しました。 Horizon社のノックアウト細胞とは異なり、OriGene社のノックアウト細胞はHEK293TやHeLaといった一般的に使用されている細胞株であり、研究者にとってより適切な製品となります。このダブルノックアウト細胞では、タンパク質をコードする遺伝子が除去される、つまり「ノックアウト」されるため抗体ターゲットが存在しなくなります。 ノックアウト細胞のサンプルと親細胞（野生型）のサンプルを並べて同じ抗体でテストし、もしその抗体が本当に特異的であれば、野生型細胞でのみ特異的なシグナルを検出し、ノックアウト細胞では検出されないはずです。 このノックアウト細胞のライセートを用いて、100以上のモノクローナル抗体のバリデーションを行いました（KOバリデーション抗体）。 ノックアウトバリデーションは、抗体の特異性テストに真のネガティブコントロールを提供すると考えられています。
しかし、ノックアウトバリデーションは、抗体の単特異性を確認するのに十分なのでしょうか。 まず第一に、ノックアウト細胞の標的外効果については、現段階では十分に研究されていません。 つまり、ノックアウト細胞では、目的のタンパク質の発現がなくなるだけでなく、抗体と交差反応するタンパク質である別のタンパク質の発現もなくなったり、低下したりする可能性があるのです。 つまり、ネガティブシグナルは、抗体が目的のタンパク質以外の他のタンパク質と反応しないことを必ずしも意味しないのです。 次に、ノックアウト細胞・組織での検査は、非必須タンパク質にのみ可能です。 必須タンパク質の場合、ノックアウトは不可能です。
数年前、オリジンは抗体の特異性を調べるために、プロテインアレイ法を開発しました。 このチップには、ニトロセルロースでコーティングされたスライドグラス上に、1万個の過剰発現したヒトタンパク質が重複して含まれています。 このプロテインマイクロアレイ技術は、多くのOriGeneUltraMAB™モノクローナル抗体の特異性を検証するために使用されています。 チップ上のタンパク質の数を増やすことで、抗体の交差反応性をヒトプロテアソーム全体にわたってさらに調べることができます。 技術の進歩に伴い、抗体バリデーションのための貴重な資産や標準化された手順が増えることで、科学者は、抗体ベースのアッセイからポジティブなシグナルを得たときに同じ疑問に直面することがなくなるでしょう。