Antioxidant enzymes, inflammatory indices and lifestyle factors in older men: a cohort analysis

Abstract

虚血性心疾患のケアフィリー前向きコホート研究において，血中の抗酸化酵素活性，炎症状態の指標，多くのライフスタイル要因との関連性を検討した． 本研究は1979年に開始され，代表的な男性人口標本に基づくものである。 当初、2512人の男性が第I相で受診し、第II相および第III相で5年ごとに追跡調査を受け、最近、第IV相で受診している。 社会階層、喫煙習慣、アルコール摂取に関するデータがアンケートで得られ、肥満度が測定された。 抗酸化酵素活性と炎症状態の指標は標準的な手法で推定された。 年齢とα-1-アンチキモトリプシン（p<0.0001）およびケルロプラスミン（タンパク質および酸化酵素）（p<0.0001）、喫煙習慣とα-1-アンチキモトリプシン（p<0.0001）、ケルロプラスミン（タンパク質および酸化酵素）（p<0.0001）およびグルタチオン過酸化物（GPX）（p<0.0001）で有意差が観察された。0001）、社会階層とα-1-アンチキモトリプシン（p<0.0001）、ケルロプラスミンのタンパク質（p<0.001）と酸化酵素（p<0.01）、GPX（p<0.0001）、ボディマス指数とα-1-アンチキモトリプシン（p<0.0001）、ケルロプラスミン・プロテイン（p<0.001）、であった。 アルコール摂取と測定した血中酵素のいずれにも有意な関連は認められなかった。 因子分析により、3因子モデル（データセットの変動の65.9％を説明）が得られ、抗酸化物質間の密接な相互関係を示しているようであった。 近年、動脈硬化の進展におけるフリーラジカルの病的な役割に注目が集まっています2-5。身体は、様々な酸化物質の有害な影響を最小限に抑えるために、複雑な防御戦略を発展させてきました。 この防御の中心となるのが、血液中の抗酸化酵素である。 抗酸化酵素には、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD, EC 1.15.1.1 ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（GPX, EC 1.11.1.9 ）、カタラーゼ（EC 1.11.1.6 ）、カエルロプラスミンがあり、これらは協調して酸化的なダメージから生体を保護します6。 赤血球スーパーオキシドジスムターゼは、銅に依存し（亜鉛は構造的な役割を担っていますが）、スーパーオキシドO2-からH2O2とO2への分解を促進させます。7 セレンを含む酵素グルタチオンペルオキシダーゼは、還元型グルタチオン（GSH）とH2O2を基質としてH2Oと酸化型グルタチオン（GSSG）を生成し、H2O2を解毒する8 GSSGは、酵素グルタチオン還元酵素によってGSHに還元され、還元剤としてNADPHが必要となり、後者は酵素グルコース6 -リン酸脱水素酵素（G-6-PDH、EC 1.)を通じて供給される。1.1.49). カタラーゼは、活性部位にヘム結合した鉄を含む大きな酵素である。 血漿中では、カエルロプラスミン（オキシダーゼ）が、生体を酸化ストレスから守る重要な抗酸化剤として働いている9。 この後者の酵素は、α-1-アンチキモトリプシンと共に、急性期反応物質でもあり、炎症状態を示すのに使用される。-12 心筋の抗酸化酵素活性と過酸化脂質に及ぼす加齢の影響をラットで調べた他の研究では、心筋の抗酸化能が加齢により弱まり、酸化的障害の可能性が高まることが示されている13。 ヒトにおいては、動脈硬化の主要な危険因子である喫煙が血漿中のグルタチオンペルオキシダーゼ活性を低下させることが示されている14。この研究の著者らは、喫煙者は持続的に酸化的負荷を受けており、不十分な抗酸化状態と喫煙によるフリーラジカル負荷の増大が相まって、LDLの酸化を悪化させ動脈硬化の性質を高めるという見解と一致している、と論じている。 このことは、冠動脈疾患のリスクが高い集団において特に言えることかもしれない。 グルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ活性の低下は、冠動脈心疾患患者15や急性心筋梗塞患者の血小板でも観察されている16-17

抗酸化酵素活性と心疾患に関する研究のほとんどは、比較的少ないサンプルを使って、高度に選択した被験者で行われている。 Caerphilly prospective cohort study of ischaemic heart disease, stroke and cognitive declineは、代表的な男性集団の血中抗酸化酵素活性を調べ、抗酸化酵素活性と年齢、社会階層、喫煙習慣、アルコール摂取との相互関係の可能性を探る機会となった。 第1期（1979-1983年）では，45-59歳の男性2512人が受診した。 その後、5年ごとに追跡調査が行われ（第II相、第III相）、最近になって第IV相が行われた。 55-69歳の時（第III相）、血中抗酸化ビタミンと酵素の測定のために空腹時採血が行われた。 残念なことに、この推定を行う機会が訪れる数カ月前に男性の検査が開始されていたため、数百人の男性から抗酸化物質の推定に必要な血液を採取することができなかった。 血漿と赤血球は低速遠心分離で分離し、赤血球は生理食塩水で洗浄した。 血漿と洗浄した赤血球は分析前に-70℃で保存した。

抗酸化酵素は以下のように標準的な方法で推定した。 スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ活性は、Randox Laboratoriesが供給する市販のキットを使用してCobas Fara自動分析装置で推定された。 赤血球カタラーゼ活性はVarian Cary 1 spectrometerを用いてAebi22の方法で推定した． 赤血球ヘモグロビン（Hb）は，Dacie and Lewis23の方法を改良し，専用のヘモグロビノメーター（Coulter Electronics）を用いて測定した． 測定は，製造元が推奨するB.S. 3985（BDH）準拠のシアン・メトヘモグロビン（HiCN）標準物質を用いて校正した． 急性期タンパク質であるα-1-アンチキモトリプシンおよびケルロプラスミンは，Dako社製の市販キットを用いて免疫比濁法で推定した．ただし，これらの分析に用いたアリコートは，Cobas Fara自動分析装置で測定する前に自動希釈ではなく，手動で希釈した． Caeruloplasmin oxidase (CpO) 活性は、p-phenylenediamine dihydrochloride を基質として Cobas Fara で推定された24。

統計解析

測定された様々なパラメーターの分布は、Kolmogorov Smirnov検定を用いて正規性を検討された。 結果は、平均値、中央値、標準偏差（SD）、および必要に応じてデータの変換後に得られた平均値と95％範囲として提示される。 様々なデータセット間の相互関係は、相関、相関行列での回帰、因子分析によって調べられ、これらのために、変量は、必要に応じて、正規性または正規性に近い状態を得るために、通常は対数で変換された。 因子分析は、変数の相互関係を単純化し、複雑なプロセスの理解を容易にするような、比較的少数の因子または基礎的な構成要素を抽出する目的で行われた

結果

第III相試験時（1989-1993）のコホート内の男性は2154人であった。 Caerphillyコホートの男性で調査された抗酸化酵素の平均値、中央値、SDは表1に示されている。 SODとGPXのみが正規分布であることがわかった。 結果は、すべての酵素について、生データとして、また対数変換して示している。 コホート内の様々な抗酸化酵素の相互関係（相関係数として表示）を表2に示す。 特に、α-1-アンチキモトリプシンやケルロプラスミン（タンパク質と酸化酵素）など、炎症状態に関連した指標との間に、有意な相関関係が認められた。 血中酵素レベルの関連性は、年齢、喫煙習慣、社会階層、肥満度、アルコール摂取量など、多くの変数とも比較された。 その結果をTable 3に示す。 データは生データとして調べ、交絡因子の影響を考慮するために標準化した。 両者の間に大きな違いはなかった。 したがって、標準化したデータのみを提示する。 年齢とα-1アンチキモトリプシン、ケルロプラスミン（タンパク質および酸化酵素）、喫煙習慣とα-1アンチキモトリプシン、ケルロプラスミン（タンパク質および酸化酵素）、GPX、社会階層とα-1アンチキモトリプシン、ケルロプラスミン（タンパク質および酸化酵素）、GPX、肥満度とα-1アンチキモトリプシン、ケルロプラスミンタンパク質との間で有意差が見られた。 8318>

血漿7変数（n=1689）に因子分析を適用したところ、固有値2.24と1.40の2つの共通因子が得られ、合わせてデータセットの全変動の52.1％を説明することができた。 第1因子は、データセットの全変動の32.0%を説明した。 これは、α-1-アンチキモトリプシン、ケルロプラスミンタンパク質、オキシダーゼと最も密接に関連していた（そして、SODとカタラーゼとはそれほど重要ではない程度に）。 第2因子は全変動の20.1%を説明した。 これはSOD、カタラーゼ、G-6-PDH、GPXと最も密接に関連していた。

モデルの妥当性の測定は、3つの変数の低い共同性（SODは0.42、G-6-PDHは0.34、GPXは0.18）がモデルを受け入れ不能にしたという顕著な例外を除いて、適切であった。 第3因子は、個々の変数が説明するよりもデータセットにおける総変動のわずかな部分を説明するが、変数の共通性（およびモデルの妥当性の他の尺度）は改善し、このモデルが観察された変数間の相互関係のより適合した記述を提供することを示す。 第3因子は、データセットの総変動のさらに13.8%を説明し、3因子モデルの合計は65.9%になります。 因子1は、依然として、α-1-アンチキモトリプシン、ケルロプラスミンタンパク質、オキシダーゼと最も密接な関係がある。 第2因子はSODとカタラーゼに最も密接に関連している（G-6-PDHの程度もかなり低い）。 因子3はGPXおよびG-6-PDHと最も密接に関連している。

2因子モデルに対して3因子モデルの妥当性における最も顕著な改善は、GPXの共同性の改善（0.18から0.78まで）である。 SODとG-6-PDHの共同性もまた改善された（0.63と0.42に）。 GPXは、3因子モデルには含まれない特別な役割を担っているようである。 南ウェールズのケルフィリーは、典型的な工業・住宅地域であるが、社会階級の分布から、肉体労働者に偏りがある可能性が示唆されている。 本研究の目的は、記述統計量を求め、データ削減と仮説構築の手法として因子分析を用いて、血中抗酸化酵素活性間の相互関係の可能性を検討することであった。 さらに、抗酸化酵素といくつかのライフスタイルの変数との関係の可能性についても調査した。 現在、抗酸化酵素であるSOD、GPX、カタラーゼの決定的な基準範囲はないが、抗酸化酵素と生活習慣の要因との関係の可能性を探る前に、まず結果を既報のデータと比較した。 SOD 活性は測定システムによって異なるため、キットメーカーは基準範囲を推奨していない。 しかし、Caerphillyのサンプルで得られたデータは、同じ分析キットを用いた過去に発表された結果と同等である30。GPXの活性もまた、分析システム内および分析システム間で異なる可能性がある。 酸化型GPXは、検体中のヘモグロビンを安定化させ、他の酵素反応の発生を防ぐために用いられるDrabkins試薬に含まれるシアン化物によって失活しやすいと考えられている31。この問題は、希釈バッファにジチオスレイトール/亜ジチオナイトを加えることで克服された。 Caerphillyコホートの結果（38.0±11.0SD IU/g Hb）は、最近発表された研究（36.1±6.5 IU/g Hb）と同様である32。ただし、後者は非常に少数の（n＝10）心筋梗塞患者に基づいている。 Caerphillyのコホートにおける平均カタラーゼ活性は、我々の研究室が以前に行った50-54歳男性のグループ（52.9±17.1、49.0±20 K/g Hb、n=18）の、はるかに小さいながらも同等のものであり、さらに、彼らは以前の研究よりも高いカタラーゼ活性を持っていた（31.使用したG-6-PDHキットのメーカーは、1.31±0.13 (mean±SD) U/gHbという「正常値」を提示しており、これは本研究で得られた1.32±0.7 U/g Hbという結果に匹敵するものである。 本研究で測定されたものは、陽性急性期タンパク質として知られている（すなわち、それらは疾患状態で増加する）。 α-1-アンチキモトリプシンおよびケルロプラスミン（タンパク質）の平均値は、それぞれ0.3〜0.6g/lおよび0.15〜0.6g/lと、以前に確立された基準範囲34内に収まった。 また、EPIC研究の英国部門のコホートと同程度であることが指摘された35。一方、ケルロプラスミン酸化酵素活性は、1994年の調査の値とほぼ同じであった。36 表3から、全体として血中抗酸化酵素は年齢による変化が少ないことがわかる。 予想されたように、急性期タンパク質（炎症状態の指標）は年齢と正の相関があった。 急性期タンパク質はいずれも喫煙習慣と有意な正の相関を示した。 GPXだけが喫煙習慣と有意な関係を示した（陰性）。 赤血球GPX活性は、以前、非喫煙者に比べて喫煙者で低いことが示されている37。これはおそらく、煙に含まれるフリーラジカルのために、このグループで起こると考えられる酸化ストレスの増加を反映していると考えられる38。 GPXは、社会階層と有意な関係を示した唯一の酵素であり、その活性はマニュアル群で低下していた。 BMIは、調査した他のライフスタイル因子と同様のパターンを示したが、その関連性はそれほど強くはなかった。 低階級の社会階級で観察された傾向や関連は予想外ではなく、喫煙や食事などの環境状況やライフスタイル要因が、おそらくより高いレベルの炎症やBMIの上昇に寄与しているのだろう。 因子分析により、多くの興味深い側面が明らかになった。 モデルの第1因子は、炎症性メカニズムを通じてリンクしている3つの尺度を集めたものである。 第2因子は2つの「主流」抗酸化物質、すなわちSODとカタラーゼを含んでいる。 第3因子がGPXとG-6-PDHと最も密接に関連しているという観察は、理論的に予測されることである。後者の酵素は、グルタチオンを還元するための還元型補因子を生成し、それが前者の酵素によって利用される可能性があるからである。 グルコース-6-リン酸は細胞のグルコース代謝の中心分子であり、ペントースリン酸サイクル活性に決定的な影響を与え、NADPH生成を通じて、ラジカル解毒やコレステロールやトリグリセリド合成のためのGPX活性を調節することを示す証拠がある39

銅亜鉛SOD酵素はO2–をH2O2に変換している。 赤血球GPXはH2O2を高速で除去することができ、GSHをGSSGに酸化させる。 GSSGはG-6-PDから生成されるNADPHによってGSHに還元されることができる。 カタラーゼは、H2O2（特に好中球の呼吸バーストによって生じる）を直接H2Oに分解して破壊する能力がGPXよりも高く、酵素1分子あたり1分間に破壊されるH2O2分子という点では、既知の酵素の中で最も活性の高いものの1つである。 しかし、H2O2に対する親和性も低く、高い活性を得るためには高いH2O2濃度を必要とし、低濃度のH2O2に対してはゆっくりとしか作用しない。

H2O2分子は細胞膜を容易に通過する能力を持ち、もし細胞外で生成すれば、抗酸化酵素による代謝のために（赤血球を含む）最も近い細胞内に拡散することが可能である。 したがって、赤血球や他の種類の細胞は、H2O2の「吸収源」として機能する可能性がある。 このように、抗酸化物質の防御機構と炎症（または酸化ストレス）の指標とが相互に関連していることが、3因子モデルで描かれていることなのだろう。 このことは、血中のバランスのとれた、協力的な抗酸化防御システムの概念を支持している。このシステムは、単一の抗酸化物質の濃度や活性よりも、多くの抗酸化システムの最適なレベルに依存しているが、特定の状況や状態における特定の抗酸化物質の重要性を排除したり減少させたりはしていない。 ケアルロプラスミンの変化は急性期反応物質であるα-1-アンチキモトリプシンの変化に反映され、おそらく炎症や疾患の状態に関連していると思われた。 GPXは、ライフスタイルによって有意に変化する唯一の抗酸化酵素で、年齢とともに増加したが、喫煙者、社会経済的階層が低い人、BMIが低い人では低かった。 これらの結果を総合すると、酸化的/炎症的ストレスと並行して、抗酸化作用が低下していることが示された。 因子分析の結果、データセットの変動の65.9%を説明する3因子モデルが得られ、抗酸化酵素間の密接な相互関係を示していると思われる。