最初に増幅しようとしたDNA断片の中で、ウシ血清アルブミンは有機溶媒の効果をさらに高めることがわかった。 のゲノムDNAを用いた場合、tlp2、che1P、cheA1（表1）のみが、溶媒添加物を使用せずにPCR増幅産物を生成した。 brasilenseのゲノムDNAを鋳型として用いた場合、溶媒の添加なしにPCR増幅産物が得られたのはtlp2、che1P、cheA1（表1）のみであった（図1）。 まず、1.25%, 2.5%, 5.0%, 7.5%, 10%, (w/vol) のDMSOと、同濃度のホルムアミドのPCRにおける添加物の効果を検証した(Figure 1)。 また、BSAを1-10 μg/μlで添加したPCRも行った（データは示していない）。 文献のデータと一致するが、PCR において DMSO またはホルムアミドを添加すると、2-3 kb の DNA 断片の増幅収量が増加するが、DMSO の増強効果はホルムアミドのそれよりも大きかった（図 1）。 この条件下では、DMSOの濃度を上げるとPCRの特異性が低下することも確認された(図2)。 一方、ホルムアミドの PCR 収量増加促進効果は約 2.5 kb より大きな DNA 断片では減少した (図 1)。 これらの条件下で、PCR添加剤としてBSAを単独で添加しても、有害な効果を含む有意な効果は見られなかった(Data not shown)。 BSA を DMSO やホルムアミドと併用することで、幅広い DNA 断片サイズにおいて、PCR 収量を向上させる効果が検出された（図 2）。 さらに、BSAの添加により、サイズの大きなDNAテンプレートであっても、有機溶媒を添加できる濃度の範囲が広がった（図2）。 現在のところ、ホルムアミドに関する文献では、0〜5%の濃度で使用した場合にPCR添加剤として最も有効であり、10%で完全に効果がなくなるという見解が一般的である。 その結果、BSA存在下、ホルムアミドは少なくとも10%の濃度まで、また2.5 kbまでのDNA鋳型(tlp2)には有効であるが、それ以上のサイズのDNA断片の増幅を促進できないことが示された(Fig. 1)。 この結果は、ホルムアミドが約2.5 kbまでのDNA鋳型の増幅に最も効果的であるという報告と一致しており、DMSOとホルムアミドが異なるメカニズムでPCR収量を増加させるという考えをさらに裏付けるものである。 これらの違いに関わらず、このPCRにBSAを添加すると、2つの溶媒のいずれかをPCR添加剤として使用したときに見られた有益な効果をさらに促進、拡大するように思われた。 高濃度の有機溶媒がシーケンシングやクローニングのような繊細な下流工程に悪影響を及ぼす可能性を考えると、BSAの添加による増強効果は重要である。 BSAがDMSOやホルムアミドとどのように共存するのかを知るために、10、15、20、25、30サイクルのPCRを行い、増幅収量に対するBSA添加の効果を分析した。 この解析により、BSA単独ではなく、DMSOまたはホルムアミドをPCRに添加することで収量が増加することが確認された（図3）。 BSAをDMSOやホルムアミドと併用した場合、すべてのテンプレートで最初の15サイクルのみで収量の増加が検出された（図3）。 この増加は、最初の15サイクルを通して、収量の10.5%増加（che1P）から収量の22.7%増加（cheA1）までの範囲であった。 さらに、BSAの有効濃度は、増幅されたDNA断片の大きさとともに増加し、収量の増加が検出されない最大BSA濃度（10μg/μl）まで増加することがわかった。 また、この条件下で最大濃度のBSAを添加しても収量の減少は見られなかった（図4）。 BSAのPCR収量増加効果は周期的に限定されていることから、このタンパク質は時間の経過とともに変性し、その効果が失われる可能性が示唆された。 この仮説を検証するために、DMSO またはホルムアミドと BSA を上記で決定した最も効果的な濃度で最初の反応バッファーに加え、10 サイクル行った後に新しい BSA の溶液（最終濃度 0-10 μg/μl） を加える PCR を設定した。 BSAの添加を30PCRサイクルに渡って繰り返し、収量への影響を上記のように分析した。 PCRの10サイクルごとにBSAを添加すると、収量の持続的な増加が検出された。例えば、cheA1の増幅では、溶媒のみの場合よりも約75%増のPCR収量が得られた（図4）。 我々が「BSA PCR step」と呼んでいる方法で得られた結果は、BSAの変性がPCRの15サイクル目以降に収量増加効果の低下を引き起こすという仮定と一致するものであった。 グリセロールや蒸留水を10サイクルごとに添加した対照実験ではPCR収量は増加しなかった。このことは、BSAの効果が反応容積の変化や、PCRにおけるグリセロールの効果の一部とされる分子クラウダとしてBSAが有効に作用することによるものでないことを示している 。 BSAのPCR収量増加効果の正確なメカニズムは不明であるが、今回得られたデータや文献に記載されているデータは、BSAがDNAポリメラーゼを安定化させ、高濃度の有機溶媒がDNAポリメラーゼ活性に及ぼす潜在的阻害効果を打ち消しているのではないかという仮説を裏付けている。 本研究で用いた最もGC含量の高いDNA断片であるcheA4（73%）の増幅では、DMSOと同様にBSAを添加することでPCR収量が増加したが、複数の非特異的増幅産物も検出された（図5）。 この問題を解決するために、次に BSA PCR ステップ法を、以前から PCR の特異性を向上させることが示されている “Touchdown” PCR プロトコルと組み合わせて使用した。 この方法では、単一の特異的バンドが得られ、”Touchdown “プロトコルと有機溶媒のみを使用した場合の収量のほぼ2倍（96%増）が得られた（図5）。 これらの結果は、QuickChange Stratagene Mutagenesis Kit (Stratagene)に記載されている全プラスミド部位特異的変異導入法を用いて GC-rich DNA テンプレート（ここでは tlp2 遺伝子、GC 66% の 2.5 kb 断片）に変異を導入する場合の比較的低い効率を改善する方法を示唆するものでもあった。 pUCtlp2を鋳型として、tlp2内に1塩基対の置換を導入するように設計した変異導入用プライマー（メーカーのホームページに従って設計した変異導入用プライマー）と共に、メーカーのプロトコルにしたがって部位特異的変異導入を行ってみると、pUCtlp2に相当する5324 kb断片はほとんど確認できなかった（図5）。 製造元の指示に従って変異導入プロトコルを完了すると、所望の変異を欠いた親プラスミドを含むコロニーがないか、少数のコロニー（平均で5個以下）が得られた。 このような結果は、突然変異誘発の収量が低いことを特徴としており、以前からこの方法の共通の落とし穴として認識されていた 。 しかし、5ステップごとにBSAをバッファに添加すると、はっきりとした増幅産物が検出された（図5）。 また、製造元のプロトコルに従った結果、2/3が目的の変異を有する100以上のコロニーを得ることができた（シークエンスにより決定）。 さらに、BSA PCR のステップをオーバーラップ伸長プロトコルに適用し、A. brasilense 遺伝子 (ATM, 650 bp) とシアン蛍光タンパク質 (CFP) (720 bp) とのキメラタンパク質融合体を構築した。 オーバーラップエクステンションPCRでは、まず2組のプライマーペアを用いて、互いに短いオーバーラップ配列で生成される融合すべき2つのDNA断片を増幅させる。 3回目の増幅では、最初の反応の増幅産物をテンプレートとして、一番外側のリバースプライマーとフォワードプライマーを用いて、キメラコンストラクトを生成する . 最初の2つのDNA断片、ATMとCFPの増幅は、標準的なPCRプロトコルを用いて非常に効率的であり、BSA PCR Stepプロトコルを用いても大きな増加は得られなかった（Data not shown）。 しかし、2回目のオーバーラップPCRステップでは、多数の非特異的増幅産物が生じ、目的のキメラアンプリコン（ATM-CFP；表1）は、あったとしても、ほとんど得られなかった（図5）。 Touchdown」PCR法を用いると、非特異的増幅産物は消失したが、特異的な目的のキメラアンプリコンは非常に微弱な1,370 bpのATM-CFPバンドで検出されるように、非常に少ない量で残った(図5)。 BSA PCR Step法とTouchdownプロトコルを併用することにより、ATM-CFPキメラアンプリコンの収量が72%増加した(図5)。 その後のクローニングとシークエンスにより、正しいキメラコンストラクトが得られていることが確認された。
GC-rich templatesのPCR増幅に対するDMSOとホルムアミドの効果。 2〜3kbのGC-rich DNAテンプレートのPCR増幅に対するDMSOとホルムアミドの添加濃度の違いの影響の典型例。 A) PCR産物全体のゲル電気泳動で観察されたche1P（上）およびtlp2（下）のPCR増幅に対するDMSOの効果。 ゲルはエチジウムブロマイドで染色し、写真に収めた。 B) 比較実験におけるche1P（上）およびtlp2（下）のPCR増幅に対するホルムアミドの効果
有機溶剤と共同添加物として使用したBSAのPCR収量増加効果。 GC-rich DNA鋳型のPCR増幅における、DMSOおよびホルムアミドと共添加剤としてBSAを異なる濃度で使用した場合の効果の典型的な例。 A) PCR産物全体のゲル電気泳動で観察した、che1PのPCRに対するDMSOの効果（左）およびDMSOと6μg/μl BSAの複合効果（右）。 B) 比較実験におけるche1PのPCR増幅に対するホルムアミドの効果（左）およびホルムアミドと6μg/μl BSAの複合効果（右）
PCR Yieldに対する有機溶剤と共同増強としてのBSA付加の効果。 PCR収量の増加は、何も添加せずに得られたPCR収量との相対値で表される。 すべてのパネルにおいて、以下の凡例が適用される：赤線、DMSO（7.5%）のみ；緑線、ホルムアミド（2.5%）のみ；紫線、DMSO（7.5%）とBSA（6 μg/μl）；水色、ホルムアミド（2.5%）とBSA（6 μg/μl）。 A) che1PのPCR増幅（392 bp）； B) tlp5PのPCR増幅（798 bp）； C) tlp2のPCR増幅（2,638 bp）； D) PCR amplification of cheA1 (3,389 bp); E) PCR amplification of cheOP1 (7,103 bp).
BSA が有機溶剤と共同添加剤として PCRの中間段階に補足した場合の効果。 A) 広いサイズ範囲（392bpから7,103bp）のDNA断片に対して10サイクルごとにBSAを添加した場合のPCR収率に対する効果；B) DMSO存在下でcheA1（3，389bp）のPCR増幅に対するBSA添加の効果の代表例で、増幅したDNA断片の分析によりゲル電気泳動で検出される。
各種PCR用途における有機溶媒との共添加剤としてのBSAの作用効果。 A) “Touchdown” PCRプロトコルにおけるcheA4のPCR増幅に対するDMSO効果の共添加剤としてのBSA添加（BSA Step）の効果の代表例で、ゲル電気泳動により検出される。 B) 部位特異的変異導入法（QuickChange site-directed mutagenesis, Stratagene）で使用したBSA StepプロトコルのpUCtlp2のPCR増幅に対する効果の代表例で、ゲル電気泳動により検出される。 C) オーバーラップエクステンションPCRで使用したBSA Stepプロトコルの効果の代表例で、ATMとCFPを融合し、ATM-CFPを得た。