SanesとLichtmanは前核注入により、これらのBrainbowコンストラクトをマウスに挿入した。 彼らはマウスの脳を画像化したところ、構築物の複数のコピー（Brainbow-1.0マウスでは約8個）のタンデム統合により、3～4色よりも多くの色を発見しました。 コピー数が3つであれば10色になると考えられるが（右表参照）、SanesとLichtmanはコピー数が多いために90〜160色もの色が観察されたと報告している。 Brainbowという名前は、まさにこのカラフルな技術にぴったりです。
システムの最適化。 Brainbow-3
Brainbow は、神経科学者に個々の神経細胞をマークするために必要な膨大な色の配列を提供しましたが、このシステムは多くの制限にも悩まされていました。 まず、Brainbow マウス組織のイメージングが困難でした。これは、蛍光色素の光不安定性によって部分的に生じる低い蛍光強度と、蛍光色素がニューロンの体節に凝集する傾向のためです。 第二に、このシステムでは免疫染色による解析が不可能であった。 使用した蛍光色素は蛍光強度が異なるものの、そのタンパク質配列は非常に相同性が高く、各蛍光色素に特異的な抗体を設計することができない。 第三に、Brainbow-1とBrainbow-2にはそれぞれ「デフォルト」状態があり、例えば、Brainbow-1.0は組換えを行っていないときにRFPを発現する。 このデフォルト状態は、大多数のニューロンで不均衡に発現しており、与えられた領域で観察できる色の数が制限されていた。
2013年、Dawen Caiらは、上記の限界を克服する目的で、Brainbow技術の改良版であるBrainbow-3.0を発表しました。 まず、さまざまな蛍光タンパク質をスクリーニングし、理想的な特性（凝集が少ない、光安定性が高い、固定後の安定性が高い）を持つタンパク質を探し出し、得られた7つのタンパク質から、蛍光と配列の重複が少ない3つ（サンゴmOrange2、クラゲEGFP、イソギンチャクmKate2）を選んだ。そしてこれらのタンパク質に対してカスタム抗体を作成し、交差反応がないことを確認して免疫染色解析への扉を開くことに成功したのだ。 さらに、細胞内を均一に標識するために、細胞膜に直接輸送される蛍光タンパク質のファルネシル化誘導体を作製し、この蛍光タンパク質を細胞膜に導入した。 Brainbow-1.0の一般的な構造はそのままに、mOrange2、EGFP、mKate2を蛍光体として使用し、mOrange2がデフォルトの状態となっています。 一方、Brainbow-3.1および-3.2はプロモーターの直後に翻訳ブロックSTOPカセットが付加されているため、デフォルトの蛍光を示すことはない。 STOPカセットには蛍光を発しない変異型YFPが含まれているが、免疫染色で検出することができる。 この機能により、Cre陰性Brainbowマウスのスクリーニングが容易になり、コンストラクトが発現している細胞の数と種類を決定することができる。 Brainbow-3.2 の光安定性は、導入遺伝子タンパク質レベルを増加させるために一般的に使用されるウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素 (WPRE) の追加により改善されています。
Brainbow のバリエーションとマウス脳以外のアプリケーション
Brainbow システムの改良に加え、Sanes と Lichtman は、機能的には Cre ベース Brainbow に似ているが FLP/FRT リコンビナーゼによって制御されている、補完的 Flpbow 構成体も開発しました。 異なるプロモーター下に置かれた場合、BrainbowとFlpbowは異なる細胞集団を標識するために使用できる。
Brainbow導入遺伝子とCreを有する動物を生産するために必要な動物の繁殖を減らすために、CaiらはCreとXFPの両方を含むAutobow構築物も作成した。 Creの産生は組換えとXFP選択を駆動し、次いでCreの自己切除を行う。 これらの構築物は、少なくとも6世代にわたって安定に維持される。
ニューロンpThy1-Brainbow構築物に加えて、Addgeneはまた、2つのBrainbowアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）-AAV-EF1a-BbChTおよびAAV-EF1a-BbTagBYを利用可能である。 これらのコンストラクトは、AAVに関連するサイズの制限により、それぞれ2つのXFPを含んでいます。両方のコンストラクトを共感染させると、最低8色の発色が得られます。 AAVを使用することで、生殖細胞系列の改変を必要としない空間的・時間的制御が可能となり、Brainbowを様々な生物種で使用することができます。
他の研究室によって、Hugo J. Snippert, et al. (2010)に記載されているR26R-Confettiや、Karine Loulier, et al. (2014)に記載されているMAGIC Marker戦略など、さらなる変異体が作成されている。現在、Brainbow技術はショウジョウバエやゼブラフィッシュなどのモデル生物研究にも適用されている。 ショウジョウバエのBrainbowは、運動ニューロンや神経筋接合部の接続など、神経回路のマッピングに役立っている。 ゼブラボウ」は角膜上皮の発生を追跡するために使用されました。
神経科学や発生に興味のある科学者にとって、Brainbow は、色の配列が幅広く、安定性が高いため、単一細胞をマークして追跡する貴重なツールとなっています。 SanesとLichtmanは、Brainbowのカラフルなラベリングによって、脳のあるセクションのマッピング時間が少なくとも1桁は短縮されたと見積もっています。 Brainbowの技術がさらに洗練されれば、脳やその他の生物学的システムの複雑な物理的構成について重要な洞察を得ることができるのは明らかです。 Addgeneで入手可能なBrainbowプラスミドをチェックしてみてください！
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Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.「Brainbow プラスミドは、神経系における蛍光タンパク質のコンビナトリアル発現のためのトランスジェニック戦略です。 リベットJ、ワイズマンTA、カンH、ドラフトRW、ベニスRA、サネスJR、リヒトマンJW。 Nature. 2007年11月1日;450(7166):56-62。 PubMed.
A technicolour approach to the connectome. リヒトマンJW、リヴェットJ、サネスJR. ネイチャーレビュー・ニューロサイエンス。 2008 Jun;9(6):417-22. doi: 10.1038/nrn2391. Epub 2008年4月30日。 PubMed.
腸のクリプトホメオスタシスは、対称的に分裂するLgr5幹細胞間の中立的な競争から生じる。 Snippert HJ, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, Barker N, Klein AM, van Rheenen J, Simons BD, Clevers H.細胞. 2010年10月1日;143(1):134-44. PubMed.
ショウジョウバエのBrainbow：神経発現パターンを細分化するリコンビナーゼベースの蛍光標識技術. Hampel S、Chung P、McKellar CE、Hall D、Looger LL、Simpson JH. ネイチャー・メソッズ。 2011 Mar;8(3):253-9. doi: 10.1038/nmeth.1566. Epub 2011年2月6日。 PubMed.
Flybow: Drosophila melanogasterにおける神経回路解析のための遺伝的マルチカラー細胞ラベリング。 Hadjieconomou D, Rotkopf S, Alexandre C, Bell DM, Dickson BJ, Salecker I. Nature Methods. 2011年3月;8(3):260-6. doi: 10.1038/nmeth.1567. Epub 2011年2月6日。 PubMed.
Improved tools for the Brainbow toolbox（Brainbowツールボックスの改良版）。 Cai D、Cohen KB、Luo T、Lichtman JW、Sanes JR。 Nature Methods. 2013年5月5日:10(6):540-7. doi: 10.1038/nmeth.2450. Epub 2013年5月5日。 PubMed.
Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.によるゼブラフィッシュの細胞追跡と系統解析。 Pan YA, Freundlich T, Weissman TA, Schoppik D, Wang XC, Zimmerman S, Ciruna B, Sanes JR, Luchtman JW, Schier AF. Development. 2013 Jul;140(13):2835-46. doi: 10.1242/dev.094631. PubMed.
Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels（コンビナトリアルラベルを用いた多重細胞・系統追跡）。 Loulier K, Barry R, Mahou P, Le Franc Y, Supatto W, Matho KS, Ieng S, Fouquet S, Dupin E, Benosman R, Chédotal A, Beaurepaire E, Morin X, Livet J.ニューロン（Neuron）. 2014 Feb 5;81(3):505-20. PubMed.
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