Non-organoid Approaches
今日まで、腸管上皮細胞株は腸管輸送過程を評価する主要なin vitroモデルシステムであり、腸内分泌細胞株は異なる腸ホルモンの分泌を研究する共通のモデルであった。 小腸腸管細胞のモデルとして確立されているのは、結腸腺癌に由来するCaCo-2細胞株（またはCaCo-2 TC7サブクローン）である。 この細胞株は、放射性標識または蛍光標識基質を用いた栄養素、薬物、または他の化合物の腸管輸送に関する研究のために、一般的に増殖後3または4週間までトランスウェルプレート上で培養される（Farrellら、2013；Ganapathyら、1995；WangおよびLi、2017）。 HT-29細胞（およびサブクローン）は、腸管トランスポーター、特に糖トランスポーターの研究のためによく確立されたヒト結腸癌細胞株である（Delezayら、1995年；Liuら、2016年）。 しかしながら、腸の栄養感知におけるトランスポーターの役割を研究するためには、他の細胞株が必要である。 腸管ホルモン分泌の研究に用いられる最も著名な腸内分泌細胞株は、マウスGLUTag細胞株（Emeryら、2015）、マウスSTC-1細胞株（Jiangら、2016）、およびヒトNCI-H716細胞株（Paisら、2014）である。 しかし、いずれも生体内の腸内分泌細胞の複雑な生物学を反映していない（Kuhre et al.、2016）。 腸内分泌細胞は小腸から大腸にかけて分布しており、腸管内の位置によって異なる腸ホルモンの発現パターンが大きく異なっている（Habib et al.、2012）。 例えば、GLP-1分泌細胞（しばしばL細胞と呼ばれる）は腸管近位部から遠位部にかけて徐々に増加し、一方、GIP分泌細胞（K細胞と呼ばれる）は減少している。 このように、腸管内分泌細胞株はすべて腫瘍由来であり、栄養センシング、腸管ホルモン分泌、およびその背後にある分子および制御機構を研究するための非常に単純かつ人工的なモデル系である。 哺乳類細胞株の利点は、世界中の多くの研究室によって確立されていることである。 確立された実験プロトコルと同様に、多くの科学的データが利用可能です。 さらに、取り扱いが簡単で、培養コストも安い。 しかし、これらの細胞株はすべて、非常に単純で人工的なモデルシステムである。 これらの細胞株はほとんどが腫瘍由来であり、単一の細胞種を代表しているに過ぎず、複数の特殊な細胞種からなる腸管粘膜の複雑さを反映したものではない。 特に、栄養センシングや腸管ホルモン分泌の研究では、腸管初代細胞培養がはるかに優れたアプローチであり、過去数年で信頼できるモデルとして確立されている（Reimannら、2008）。 分離した腸小胞から培養した初代培養液は、異なる腸管セグメント（Parkerら、2012）、マウス（野生型またはノックアウト動物）（Diakogiannakiら、2013）、またはヒト（Habibら、2013）から生成できる利点がある。 これらは、本来の腸に見られるような吸収性腸細胞、および腸内分泌細胞の異なるサブタイプから構成されています。 しかし、これらの培養物には、分化度の低い腸細胞が含まれているため、タンパク質や機能レベルでの腸管トランスポーターや受容体の検出には適していない。 また、長期間の実験には向かない短期間の培養系であり、継代ができないため、培養準備に必要な実験動物の数が増えてしまう。 同じことは、単離された腸上皮細胞（Grossmannら、1998）の場合であり、それらはすべての粘膜細胞タイプを構成するが、in vitroで非常に限られた生存率を示し、無傷の上皮を代表しない。
短期間の安定性はまた、組織抽出物の制限であり、例えば、everted gut ring（Reder ら、, 2014）、またはマウスもしくはラットの腸からの腸嚢（Praslickovaら、2012；Surampalliら、2016）のような組織抽出物は、輸送研究にしばしば使用されるものであるが、短期安定性もまた制限される。 Everted gut ringsは、in vitroで標識基質とインキュベートするか、または、例えば、ネズミの放射性標識トランスポーター基質の経口投与後に調製することができる（Roder et al.、2014）。 内腔側コンパートメントと基底側コンパートメントを別々にターゲットにできるため、反転した腸嚢をフラックス研究に使用することも可能である。 しかし、準備と取り扱いは簡単ではなく、ある程度の経験が必要である。 組織抽出物の利点は、異なる腸管セグメントから調製でき、その領域固有のin vivo特性がin vitroでも保存されることである。 また、腸管組織は本来の構造を保っており、粘膜は粘膜下層や筋肉などの周辺組織とつながり、神経細胞やリンパ管、血管なども含まれています。 このことは、科学的な問題によっては、利点にも欠点にもなり得ます。 栄養素の腸管感知とその後の腸管ホルモン分泌は、灌流したネズミの腸で調べることもあります（Kuhre et al.） 動物を麻酔し、腸管内腔を推定刺激物質でex vivoで灌流する。 側底液を採取し、腸管ホルモン含有物を分析する。 この方法は技術的に容易ではなく、倫理的なハードルがあるため、栄養誘導性腸管ホルモン放出の研究にこの方法を広く使用することは制限されている。 mRNA注入後、目的のタンパク質は卵母細胞内で発現され、輸送動態は、放射性標識基質または電気原性トランスポーターの場合には電気生理学的アプローチを用いて調べることができる（Schulzeら、2014；Stelzlら、2016）。 この手法は、標的タンパク質が人工的な環境にあり、哺乳類細胞内のような制御因子が存在しないが、ある特定のトランスポーターの機能的特性を研究するための優れたツールである。 また、無傷の卵子の入手や卵子注入などの煩雑な操作が、本手法を適用する上で考慮すべき重要な問題点である。 より簡便な異種発現系として、酵母や大腸菌がある。 これらは組換え変異体の作製を可能にし、一度作製した変異体はより大きなスケールで培養または発酵させることができ、大量のタンパク質を供給することができる。 これらの微生物は安価で扱いやすいものの、哺乳類のタンパク質、特に大型の膜タンパク質を研究するには非常に単純なモデルシステムである。 しばしば起こる問題は、タンパク質のミスフォールディングや、膜への挿入の失敗である。 したがって、これらの系は、哺乳類トランスポーターの機能および制御に関する詳細な研究よりも、精製タンパク質またはタンパク質ドメインの構造特性評価（Bealeら、2015）にむしろ有用である。 CaCo-2またはHT-29などの腸細胞株は、足場上で培養され、より腸に近い構造を作り出し、これは分化の改善につながる（Chenら、2015年）。 他の3次元モデルは、コーティングされた微多孔膜上でヒト小腸上皮細胞および筋線維芽細胞から直接培養され（Maschmeyerら、2015a；Maschmeyerら、2015b）、in vitroで増殖することはできない。 これらのモデルは、栄養素や薬物の輸送研究のために確立される可能性があり、ヒト腸管上皮細胞から増殖した培養物は、異なる粘膜細胞タイプからさえ構成されるが、腸管内分泌細胞は含まれない。 また、最近注目されている3次元バイオプリント技術も同様である。 この手法は、実験研究よりも、再生医療や移植に価値がある（Murphy and Atala, 2014）。 心臓、皮膚、骨などさまざまな組織のバイオプリントは成功裏に確立されているが、腸管組織のバイオプリントはこれまで稀で、さらなる改良が必要である（Wengerter et al.、2016）
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