我々の研究において、骨盤内増殖性腫瘍が疑われる患者さんの集団で、CALR変異を発見しました。 我々は、MPNが臨床的および／または検査的に疑われたJAK2 V617F陰性患者524人のコホートにおいて、CALR変異の存在をレトロスペクティブに検出し、この検出の診断的価値を決定することを主目標とした。 観察期間中、CALR変異は最近発見されたばかりであるため、私たちのセンターではMPNが疑われる患者においてルーチンに調査されていませんでした1,2。 一方、JAK2 V617F変異は2005年に発見されて以来、すでにルーチンに分析されている20。 したがって、JAK2 V617F陽性の患者は本調査から除外された。 MPL 変異は、MPN 患者では比較的まれな所見であり、そのほとんどが ET または PMF の患者に認められます21。 私たちの研究室では、MPN が疑われる患者の診断アルゴリズムに MPL 検査が組み込まれたのはごく最近で、JAK2 V617F と CALR 変異を除外した後にのみ実施されている。
当センターは人口約100万人の地域にある大学病院で、血液学的悪性腫瘍の紹介センターである。 血液内科に紹介された患者はすべて、血液悪性腫瘍の分野に詳しくない一般開業医によって最初に評価された。 表3に示すように、血液内科に紹介された患者のうち、初診時にMPNを疑う病理学的臨床パラメータおよび/または臨床検査パラメータを持っていたのは、ほんの一握りであった。 したがって、血液内科に紹介された患者のほとんどは、380人（380/524=72.5%）の患者がMPNでないと判断されたため、血液学的悪性腫瘍を持たない患者であった。 これらの患者は、鉄欠乏、感染症や炎症性疾患、低脾症、悪性腫瘍、喫煙、最近の手術、コルチコステロイドの使用、慢性低酸素症など、さまざまな条件によって引き起こされる末梢血内容の二次的変化と診断された。 従って、我々のコホートにおけるCALR陽性患者の数は少なかった。 MPN が疑われた患者の 4.4%が CALR 陽性であり、そのほとんどが ET または PMF と診断された。 ほとんどの類似研究では、MPNと確定診断されたCALR陽性患者の数を分析しているため、CALR陽性患者の数は、12人から20％以上と、はるかに多かった22,23,24,25,26。 我々のデータに基づくと、ほとんどの場合、血液学的悪性腫瘍が原因ではないため、1つ以上の血球系譜のレベルが上昇した患者に対する診断アプローチを改善することが有益であると考えられます。 患者は、二次性赤血球増加症、血小板増加症、白血球増加症の最も一般的な原因について定期的にスクリーニングされるべきであり、血液内科に紹介する前に少なくとも1回はフォローアップ診察で血球数を再確認する必要がある。 分子遺伝学的検査は、クローン性血液疾患の疑いが強い患者に限って行うべきであり、血液内科に紹介されたすべての患者に行うべきものではない。
CALR 変異は、JAK2 V617F 陰性 ET1,2 患者によく認められます。 当センターでは、初診時に2008年WHO基準でETと診断されたCALR陽性患者は少数派（7/23＝30％）であった。 その主な理由は、中等度の血小板増加と血栓性合併症のリスクが低い患者に対して、骨髄検査が比較的控えめであったためです。 しかし、このことは、クローン性血小板減少症の患者数を過小評価していた可能性があることを意味する。 CALR突然変異の存在を確認することで、我々は、修正WHO ET基準13に従って、9人の患者をETとレトロスペクティブに診断することができました。 これらの患者はすべてクローン性血小板減少症の疑いが強いため当科で経過観察していたが，分子遺伝学的検査のような非侵襲的な方法でETの診断を確定できることは，予後的にも治療的にも大きな利点があると思われる． したがって、CALR変異は、最近文献でも確認されているように、ETの重要な診断上の特徴である27,28。
PMFの全患者は、血液内科での診察時にWHO基準に従って診断された。 CALR変異の同定はレトロスペクティブに診断を確認したが、直接的な診断や治療への影響はなかった。
CMML はMDS/MPN のサブタイプであり、厳密にMPN ではない12。 CMML患者におけるCALR変異は極めて稀であり、その病態に重要な役割を果たすことはない。 Zamoraらによるグループ研究では、 CMML患者174人中、 CALR変異を示したのはわずか1人でした29。 CMML type one と診断され、 その後骨髄線維症に進行した我々の患者は、 PMF と CMML には単球増加や骨髄線維化などの共通点が多いため、 初診時に誤診された可能性があります。 Huらによる最近の研究では、より正確な解析により、CMMLと診断された多くの患者がPMFと再分類され、特にET/PMFに典型的な分子バイオマーカーを持つ患者において、正確な診断を下すために、より詳細な解析を行うべきであることが示された11,30。 CALR変異には主に2つのタイプがある：タイプ1（52bpの欠失；p.L367fs*46）とタイプ2（5bpのTTGTCの挿入；p.K385fs*47）である。 分子的な特徴から、他の変異はtype 1-likeとtype 2-likeに分類される31。 我々の研究では、CALR突然変異の最も一般的なタイプはタイプ1であり、これは文献からのデータと一致する2,16,32。 1型でも2型でもない変異は、1型様または2型様に分類されるべきであり、これは臨床表現型、さらにはPMFの場合には生存率に影響を与える可能性があるからである17。 我々の研究における1型様変異と2型様変異の定義は、CALR変異によって変化する31のユニークなアミノ酸配列について螺旋の傾向を計算する統計的近似アルゴリズムであるAGADIR15を用いて行われた16。 このアルゴリズムは、同様の研究で使用されており、CALR変異のサブ分類における重要なツールとなっている16,17。 CALR変異のタイプを適切に定義することは、診断に影響を与えるため、極めて重要であると思われる。 リーディングフレームの＋1（-1＋2）フレームシフトにつながる変異のみが病原であることが知られている6。 その他のCALR変異は、臨床的意義が不明なCALRの生殖細胞変異である可能性がある。 我々の研究では、2人の患者で非フレームシフトのCALR変異が検出された。 このうち1名は血液内科での診察時に反応性血小板増加と診断され、レトロスペクティブにCALR陽性と定義された患者である。 詳細な解析の結果、アミノ酸位置398のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換されたミスセンスのCALR変異が確認された。 Lashoらの研究では、C末端が異なるCALR変異は、まだ知られていない別の発症メカニズムを示唆するものであると結論付けている33。 我々の研究では、この患者はクローン性血液疾患を示唆するような CALR 変異を発症していないと仮定した。 患者の病歴、臨床検査、検査所見から、反応性血小板減少症を示唆するものがほとんどであった。 この論文を書いている時点では、この患者はクローン性血液疾患に伴う合併症の可能性もなく健康であった。
非フレームシフトCALR変異を持つ別の患者はMPN-Uと診断された。 この患者はCALR遺伝子の生殖細胞系列インフレーム欠失（NM_004343.3 (CALR):c.1142_1144delAGG; p.(Glu381del) ）を持っており、MPN34の症状を持つ患者で既に認識されていた。 KDELモチーフは保たれているものの、1アミノ酸の欠失（p.(Glu381del)）により、タンパク質の二次構造だけでなく三次元構造も変化しており、このインフレーム欠失の病原性が結論づけられた23,34,35。 我々のMPN-U患者は、残念ながら経過観察中であり、正確な血液学的診断や合併症の可能性は不明であった。
本研究で我々はエクソン9に4つの新規CALR変異を発見したが，我々の知る限り，COSMIC (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) やHGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk) データベースにはまだ登録されていないものであった． COSMICデータベースは、専門家が監修した世界最大のヒト癌の体細胞変異のデータベースである。 400万以上のコーディング変異が記載されている36。 HGMDデータベースは、ヒトの遺伝性疾患の原因となる既知の（公表されている）すべての遺伝子病変を照合する試みである19。 我々の研究で定義された新規変異は、NM_004343.3 (CALR):c.1127_1145del19, p.(Arg376Glnfs*48), NM_004343.3 (CALR)：c.1154、NM_004343.3 (CALR)：c.1127_1145del19、p.（Arg376Glnfs*48）である。1154delAinsGTTGTC, p.(Lys385Serfs*47), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsTTTATC, p.(Lys385Ilefs*47), および NM_004343.3 (CALR):c.1132_1153del22, p.(Glu378Argfs*45) の各項目がある． これらの変異はすべて2型様変異であった。
ET と PMF は血栓および血栓塞栓イベントのリスク上昇と関連しており、これらは罹患率と死亡率の重要な原因である37。 血栓および血栓塞栓性合併症のリスクを低減することは、特にET患者において、治療の最も重要な目標の一つです38。 これらの患者は、治療の合併症や極度の血小板増加（血小板＜9100＞1000×109/L）による後天性フォンウィルブランド症候群（AVWS）に関連する出血性合併症のリスクも高くなります28,39,40。 ET患者における血栓症のリスクは、20％を超えています41。 スウェーデンの研究では、ET患者の35％が血管合併症を発症しています42。 PMFでは、血栓症はETと同程度によくみられます43。 PMF患者における血栓性合併症の有病率は、7～30％です44,45,46。 我々の研究では、CALR陽性患者における血栓性合併症の有病率は30％でした。 しかし、3人の患者はMPN診断が疑われる10年以上前に血栓性合併症を発症していた。 したがって、我々の研究における血栓性合併症の真の有病率は、より低かった。 1人の患者は硝子体出血を発症したが、これはワルファリンによる抗凝固療法が不十分であった結果であった。 出血性合併症のあった2人の患者のいずれも、合併症発生時に極度の血小板増加を認めなかった。 JAK2 V617F および MPL 変異と比較して、CALR は好ましい変異であり、血栓イベントの発生率は低い1,2,47。 血栓性出血性合併症を発症したCALR陽性患者のほとんどは、1型変異と診断されました（71.4％）。 すでに示したように、1型様変異の患者は2型様変異の患者に比べ血栓症のリスクが高かった10。
CALR 変異は現在、JAK2 V617F とMPL 変異に加えて、ET または PMF 患者の3 大変異型の1 つであることが知られています。 しかし、ETやPMFの患者さんの10-15％は、疾患の根底にある分子遺伝学的マーカーが不明であることが依然として残っています。 これらの患者は、「トリプルネガティブ」と呼ばれている48。 これらの患者さんでは、骨髄系がん遺伝子のコーディングエクソンの配列決定により、新しい分子バイオマーカーが探索されており、有望な結果が得られています。 MPN患者における
CALR 変異もまた、その治療の可能性について研究中である50,51,52。 CALRエクソン9変異は、免疫原性新抗原として作用することが示されているため、がん免疫療法のターゲットとなる可能性があります51。 MPNの治療では、CALRワクチンを、インターフェロンα（IFN-α）54やプログラム死1リガンド（PD-L1）55などの免疫調節治療53と組み合わせ、コンビネーショナルがんワクチンとして用いることが有効な可能性があります53。 CALR変異は、MPN患者における重要な診断・予後マーカーであることに加え、将来的にはMPN患者のサブグループにおいて重要な治療ターゲットとなる可能性があります
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