Clide channelsについて考えるまでは、教室から研究室までほぼすべてのケースを満たしている。 クロライドチャネルが存在し、重要で、いくつかの疾患領域で良い創薬ターゲットになるかもしれないことは分かっていますが、最近まで、治療薬の世界ではやや汚名を着せられ、流行遅れのままでした。 選択的なリガンドがないことも、その一因となっている。 唯一の例外は、抑制性神経伝達物質であるGABAと結合すると開口する内在性塩化物チャネルと結合しているGABA-A受容体であった。 1960年代にバリウムが発売されて以来、ベンゾジアゼピン系薬剤がこの受容体を増強し、鎮静作用と抗けいれん作用を発揮している。 これは、カリウム、ナトリウム、カルシウムに選択的な孔を形成することができるタンパク質構造の柔軟性がほとんどない陽イオン選択性イオンチャネルについて私たちが理解していることと対照的です。これらのイオンチャネルの多様性は、開閉動作に影響を与える孔とは異なるタンパク質ドメインの変動によってもたらされています。 公平に見て、陰イオンチャネルが塩化物選択性を示すべき生理学的理由はあまりないように思われる。他のハロゲン化物や小陰イオンの膜輸送にはほとんど生理学的役割がないため、陰イオンチャネルは生理学的観点から見るとデフォルトで塩化物チャネルであると言える。 一方、カリウム、ナトリウム、カルシウムの膜電流はそれぞれ異なる基本的な役割を担っており、これらの陽イオンに対する選択的な膜透過性は、細胞機能、さらには生命そのものにとって重要です。
GABA-A 受容体はシスループ五量体のリガンドゲートイオンチャネルのメンバーで、いくつかのタイプの興奮性および抑制性の神経伝達物質ゲートチャネルが含まれています。 嚢胞性線維症膜貫通制御因子（CFTR）タンパク質は、ヌクレオチド制御の塩化物チャネルである。 多様なATP-binding cassette (ABC) トランスポーターファミリーの一員であり、唯一、膜を越えて基質を輸送せず、塩化物チャネルとして機能するようである。 電位依存性塩化物チャネルのCLCファミリーは、別の異なる遺伝子ファミリーから生じ、膜タンパク質の中でユニークな一般構造を有している。 このタンパク質ファミリーは、過去30年間に多くの驚きをもたらしてきた。ここでは、このファミリーのメンバーについて紹介するとともに、それらがどのように創薬ターゲットとなりうるかについても述べる。
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カルシウム活性化塩化物（ClCa）チャネルの基礎をなすタンパク質の分子同定を受けて、塩化物チャネル分野から他の刺激的な開発が出現した。 機能的には、以前からその生理的役割について知られていたが、最近のチャネル・タンパク質の分子的同定により、その活性を探り、変化させる分子的・薬学的ツールの開発が可能になった。 本総説では、ClCaチャネルとCLCタンパク質を標的とした薬理学的可能性に焦点を当て、その機能と細胞内局在を図1にまとめている。 創設メンバーであるCLC-1は骨格筋の電位依存性塩化物チャネルであり、以下に説明する。 CLC-0は、エイが水中の犠牲者を気絶させるための電気器官であるElectroplaxから単離され、多くの機能研究が行われてきた。 CLC-0を脂質二重膜に再構成し、単一のイオンチャネルを流れる電流を電気生理学的に記録したところ、興味深い性質が明らかになった。 通常、単一のイオンチャネルを含む膜の小さなパッチから電流を記録すると、2つの電流振幅の間で揺らぎが観測される。1つはチャネルが閉じている状態、もう1つはチャネルを流れる電流が開いている状態である。 この揺らぎは、開いた状態と閉じた状態の間の運動状態の遷移を反映している。 しかし、CLC-0では、1つのイオンチャネルタンパク質が2つの等価な孔からなり、それぞれ独立して開口することが明らかになった1。 このため、このチャネルは二重バレル型と呼ばれるようになった（図2）。 そのため、腸内細菌からのホモログの結晶構造から、このタンパク質複合体が二量体で、それぞれのサブユニットがイオン伝導経路を持つことが明らかになったことは、大きな驚きではなかった2（図2）
Figure 2
二番目の驚きは、大腸菌からのCLC-ec1について詳しい機能実験が行われたときに生じた。 CLC-ec1 は、脊椎動物の骨格筋にある長い間失われていた親類のような塩化物チャネルとして機能するのではなく、2Cl-/H+ 交換トランスポーター、またはアンチポーターであり、厳密に 2:1 交換化学量論である3。 このタンパク質は腸内細菌が低pHで生存するために重要であり4、細胞内のpHを許容範囲内に保つために塩化物勾配を利用していると考えられる。 したがって、原核生物のCLCは、病原性大腸菌やサルモネラ菌の感染症を治療するための阻害剤のターゲットになるかもしれない4。 イオン交換機構の発見は、当然ながら、哺乳類のCLCに塩化物とプロトンの交換が存在するかどうかを調べる努力を促した。これは、Cl-/H+交換が典型的なCLCの真の機能で、塩化物チャネルと同定されたものは単なる例外であるかもしれないとの仮定からであった。 CLC-3からCLC-7までは主に細胞内小器官に存在する2Cl-/H+交換トランスポーターとして機能し、CLC-1、CLC-2、KAおよびKBは真の細胞膜塩化物伝導性イオンチャンネルであるという強い証拠があることから、これは事実だと思われる5〜9。 CLCの典型的な特性は交換輸送であり、あらゆる細胞生物に見られることから、後者のサブクラスである真性塩化物チャネルは、塩化物輸送と第2の基質イオンの移動との結合を失った「壊れた」塩化物輸送体であると考えることができる。
CLC-1
このCLCファミリーの創始者は骨格筋の電位依存性塩化物チャネルで、膜電位を調節し、活動電位の後に膜を再分極させて筋を弛緩させる役割を担っている。 ほとんどの組織では、カリウムチャネルがこの役割を果たすと予想され、心筋や平滑筋ではその役割を果たし、他の細胞種では膜の興奮性を調節している。 横管系は、細胞膜（サルコレマ）の延長線上にあり、収縮組織の中に入り込んでいます。 筋全体に電気活動を迅速に広げるために重要であり、迅速かつ制御された収縮を編成している。 筋細胞からt字管という限られた空間にカリウムが流出すると、細胞外のカリウム濃度が上昇し、このイオン勾配が崩れて、膜の脱分極が長引くことになる。 クロライドチャネルが再分極の主要な役割を担っているため、このような事態は防がれている。 CLC-1の機能欠損変異は、ヒト、ヤギ、マウスにおいて筋緊張を引き起こし（最近の総説は10を参照）、再分極膜電流の喪失と一致する筋弛緩障害によって特徴づけられる。
骨格筋に限定して発現しているので、CLC-1の機能を増加または減少させて筋興奮をそれぞれ減少または増加させて、筋収縮を制御する薬剤のターゲットとして魅力的かもしれない。 CLC-1の機能を高める化合物は、特にクロライドチャネル活性の部分的な低下を補うことができる場合、筋緊張症の治療が可能になるかもしれない。 CLC-1の阻害は筋収縮の閾値を下げ、筋力低下や筋ジストロフィーのような変性疾患の場合に有用と考えられる。
CLC-2
内向き整流塩化物チャネルCLC-2は、やや広範囲な組織分布を持っています。 中枢神経系に存在し、神経活動を制御している11-13。 アストロサイトでは、GlialCAM（MLC1）との相互作用により細胞接合部への局在が制御されており、この変異が局在を乱し、巨脳性白質脳症の原因となる14。 最近、CLC-2が腸管粘膜や肺気管支に発現し、それぞれ腸分泌や肺分泌に関与していることが治療上注目されている。 便秘解消のために臨床的に使用されているルビプロストンは、CLC-2を活性化することによってその効果を発揮すると提唱されたが、この効果については議論の余地がある。 この化合物は、ある研究ではCLC-2チャンネルを活性化するが、他の研究ではCLC-2のトラフィッキングを調節し、プロスタグランジン受容体の活性化を介してCFTR機能を増加させる15,16. しかし、気道のCLC-2機能を増加させることは、嚢胞性線維症における代替塩化物経路を提供できるという十分な証拠が残っている17。
CLC-KA/KB
これらの塩化チャネルは、特に腎臓上皮で発現し、受動塩化流に対する細胞膜の透過性に貢献している。 ネフロンの上行部および遠位尿細管において重要な役割を担っており、原尿から頂膜を経由して運ばれた塩化物を基底側で再吸収する経路を提供している。 CLC-KBをコードするCLCKB遺伝子は、バルター症候群の原因となる5つの遺伝子のうちの1つである。 CLC-KBの機能欠損変異は、塩化物の再吸収に異常をきたすため、多尿を伴う塩分消耗性障害につながる。 CLC-KB変異の影響を受けた人（バルターのIII型）の主な特徴の一つは低血圧である。 さらに重篤な型は、CLC-KAとKBの両方の細胞膜への輸送に重要なアクセサリータンパク質であるBarttinをコードするBSND遺伝子の変異によって引き起こされます（Bartter’s type IV）18。 この型には感覚性難聴も含まれ、内耳の上皮膜へのCLC-KAとKBの両方の輸送が失われることによってもたらされると考えられている。 おそらく、CLC-KAかKBのどちらかの活性が失われ、両方が失われることは、聴覚系に許容されると思われる。 このことは、CLC-KAまたはCLC-KBのどちらか一方に選択的な阻害剤、あるいは両方を部分的に阻害することにより、血圧を下げる可能性があり、副作用の少ない新しいループ利尿剤として作用する可能性を示唆している。 このため、その薬理作用が研究され、マイクロモル親和性の低い新規阻害剤誘導体が開発され19、ラットに投与したところ利尿作用が認められた20。 一方、CLC-KBチャネルを活性化する薬剤は、BartterのIII型患者では欠損チャネルの残存活性を高める可能性がある。
CLC-7
2Cl-/H+交換トランスポーターサブクラス中、CLC-7は薬剤作用の有望な標的でその阻害は骨粗しょう症に有用と考えられている。 もう一度言うが、この適応症はCLC-7の機能欠損変異によって引き起こされるヒトの疾患、すなわちオステロペトロシス21の観察に由来している。 この疾患では、破骨細胞による骨再形成が欠損しており、これは酸および酵素の分泌不全が原因であると考えられている。 このため、骨が密になり、CLC-7阻害剤で再現できれば、骨の溶解が抑えられ、骨粗鬆症患者の骨格を強化することができる22,23。 概念実証試験において、薬理学的な酸性化抑制24、あるいは抗体によるCLC-7の機能破壊25は、骨吸収を減少させることが示された。 しかしながら、CLC-7阻害は、ヒトおよびマウスでの研究により、CLC-7機能の欠如が、リソソーム機能の低下による神経細胞の貯蔵および変性障害とも関連することが示唆されているため、合併症がないとは言えないかもしれない26。
Loss-of-function human mutations – lessons from CFTR
この時点で、新規CLC標的薬の治療適応のいくつかは、CLC機能の欠陥によって引き起こされる障害とは異なる、スペクトルの反対側にある障害の治療を目的としていることを考えることは、小休止に値する。 上記のものに加え、デントI型はCLC-5の機能喪失に起因するX連鎖性腎疾患である（最近の総説は27を参照）。 いずれもまれな遺伝性疾患であり、主要なタンパク質の欠陥は、タンパク質活性の低下か標的膜への輸送のいずれかに関与している。 実際、多くの突然変異がERの保持とタンパク質の成熟の欠如を引き起こしている。 嚢胞性線維症では、罹患者のほとんどが小胞体保持型ΔF508変異を有していることから、これと類似したことが言える。 嚢胞性線維症の治療に対する最近の段階的アプローチは、変異タンパク質のフォールディングを修正すること（CF修正剤）、および／または、細胞膜CFTR塩化物チャネルの活性を高めること（CF増強剤）の二本立ての攻撃の結果であった。 増強剤28 は、タンパク質の生合成や輸送を損なわずに CFTR 活性を低下させる変異（例：G551D）を持つ患者に有効であり、成功しつつあるが、フォールディング補正剤（大半の症例で必要）の有効性はまだ確立されていない29。 CLCの機能喪失に関連する疾患はいずれも稀な遺伝性疾患であるが、嚢胞性線維症だけでなく、筋緊張症、バーター症候群、デント病、骨粗鬆症の患者を、実際の原因を補正する薬剤で治療できる日が来るかもしれない。
Calcium-activated chloride channels
最後に、カルシウム活性化塩化物（ClCa）チャンネルについて述べます。このチャンネルは、多くの種類の細胞で明確に定義された生理的役割をもっていますが、その分子識別はいくつかの誤りと躓きに苦しんでいます。 この話には、CLCA、Bestrophin、Tweety、TMEM16遺伝子ファミリーのメンバーである4種類のタンパク質が関わっている。 いずれの場合も、リコンビナントで過剰発現させると、細胞内カルシウム濃度の上昇と、程度の差こそあれ、膜の脱分極によって刺激される膜塩化物電流が発生する。 CLCA の旅は、このタンパク質が分泌されるだけでなく、発現系に内在する ClCa チャネルの膜発現をアップレギュレートする可能性があることが判明した時点で終わりを告げた30。 TweetyとBestrophinタンパク質は、主要な組織で研究されたClCaチャネルの特性のすべてを示すわけではないが、Best1は感覚神経におけるClCaの構成要素を担っていると考えられ31、また小胞体からのカルシウム放出の重要な調節因子である可能性もある32、33。 3つの独立した研究により、TMEM16A（Ano1とも呼ばれる）が、全体ではないにしろ、カルシウム活性化クロライドチャネルの主要構成要素の候補として提案された34-36。 分子ツールの生成によって促進された、その後の多くの研究がこれを支持している。 TMEM16Aは血管平滑筋の膜興奮性の制御に重要であり、肺高血圧の動物モデルでは発現が上昇し、チャネル阻害により緊張を緩和することができる37,38。 感覚神経では、TMEM16Aは炎症性メディエーターの存在を膜の過興奮に結びつけ、TMEM16A阻害は抗侵害受容効果を持つ39。 喘息の動物モデルでは、この特定のクロライドチャネルの発現が増加しており、その阻害は有益な効果をもたらすと考えられる40。 また、腸のカジャール間質細胞にも存在し、腸壁の平滑筋の律動的な収縮にチャネル機能が必要である41。 さらに、TMEM16Aの活性化は、嚢胞性線維症における上皮の塩化物分泌のための代替経路を提供する可能性がある42。 残りのTMEM16ファミリーの正確な機能についてはまだ議論があるが、ClCa機能はTMEM16B（Ano2）にもあるとされており、嗅毛細胞のClCaチャネルの根底にあると考えられている43,44. また、このクラスのイオンチャネルは癌細胞生物学において役割があり、その阻害は細胞増殖を防ぐ可能性がある45-48。
結語
このレビューは、塩素伝導または輸送タンパク質の多様な役割と、その機能不全がヒト疾患または動物モデルの疾患様症状にどのように関連しているかに注目した。 塩化物チャネルやトランスポーターの膜輸送を阻害、活性化、改善する薬理学的試薬は極めて不足している。 嚢胞性線維症におけるCFTRの欠陥機能を逆転させる薬物については進歩が見られ、異なるタイプの遺伝性突然変異に特異的な薬物が生まれることが期待されている。 TMEM16Aカルシウム活性化クロライドチャネルの阻害剤と活性化剤42,49は有用な実験道具であることが分かっており、新しい化合物は、特に組織特異的な効果を発揮することができれば、有効な薬となる可能性がある。 特定のCLCに特異的な分子は、おそらく最も捉えどころのないものであろう。 電位依存性CLCの活性化50の構造基盤を理解することにより、合理的な構造ベースの薬物設計によって標的となるタンパク質ドメインが特定されるかもしれない。 このようなツールにより、レビューされ、ここで紹介された新規治療法のアイデアのいくつかを試すことができるようになるのです」
Author Biography
ジョン・リピアン博士は、レスター大学でカリウムチャネルの構造、機能、薬理に関する博士号を取得しました。 オックスフォード大学で膵臓β細胞機能と糖尿病を研究した後、リーズ大学で薬理学の講師に任命された。 彼の研究は、いくつかの異なるタイプのイオンチャネルとトランスポーターの構造と生理学的特性、および新規の薬理学的試薬によるターゲティングの可能性を解明することである
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