Choline Deficiency Attenuating Body Weight Gain and Improves Glucose Tolerance in ob/ob Mice

Abstract

これまでの研究で、コリンの供給が高脂肪食によるマウスの肥満やインスリン抵抗性に直接関係していることが示された。 本研究の目的は、コリン供給が遺伝的欠陥による肥満やインスリン抵抗性をも調節し得るかどうかを評価することである。 8週齢の雄のob/obマウスに、コリン欠乏食またはコリン補給食を2ヶ月間与えた。 脂肪量と除脂肪体重を含む組織重量が評価された。 細胞内シグナル伝達、血漿グルカゴンおよびインスリン、グルコースおよびインスリン負荷試験も調査した。 コリン欠乏食は体重増加を遅らせ、脂肪量を減少させた。 コリン欠乏はまた、脂肪肝を悪化させたが、血漿グルコースレベルを低下させ、グルコースおよびインスリン耐容能を改善した。 コリン欠乏食では、脂肪分解活性の上昇、血漿グルカゴンの減少、肝グルカゴン受容体の発現低下も観察された。 この結果は、コリン欠乏食が遺伝的欠陥による肥満および糖尿病マウスの脂肪量を減少させ、耐糖能異常を改善することを示している。 はじめに

コリンは、神経伝達物質アセチルコリンの生合成や膜の主要成分であるホスファチジルコリン（PC）など、いくつかの重要なプロセスに関与している重要な食事因子である。 PCは、CDP-コリン経路、またはホスファチジルエタノールアミンN-メチルトランスフェラーゼ（PEMT）によるホスファチジルエタノールのメチル化によって合成される。 PEMT 経路は肝臓でのみ定量的に重要である。 また、コリンは神経伝達物質であるアセチルコリンの必須前駆体であり、ムスカリン受容体およびニコチン性アセチルコリン受容体を介して作用する。 近年、コリンと肥満・糖尿病との関連性が明らかになりつつあります。 また、ムスカリン性アセチルコリン受容体は、肥満の治療標的としての可能性が提唱されています。 最近、我々はPEMTの欠損が高脂肪食誘発性肥満およびインスリン抵抗性からマウスを保護することを見出した。 しかし、高脂肪食に高用量のコリンを加えると、この保護作用は消失した。 PEMT経路に続くPC異化作用は、哺乳類における唯一のコリンの生合成経路として知られている。 PEMT欠損マウスでは、いくつかの組織でコリン含量の著しい減少が認められ（Liら、未発表データ）、コリンと高脂肪食誘発性肥満／インスリン抵抗性の間に直接的な関連があることが示唆された。 本研究では、ob/obマウスにコリン欠乏食（CD）を与え、コリン欠乏が遺伝子由来の肥満やインスリン抵抗性を修飾するかどうかを評価した

2. 材料および方法

2.1. 動物および食事

すべての手順は、Canadian Council on Animal Careのガイドラインに従い、アルバータ大学のInstitutional Animal Care Committeeによって承認された。 ジャクソン研究所の8週齢の雄のob/obマウスを1週間馴化させた。 各群5匹のマウスを使用した。 マウスは2ヶ月間、コリン欠乏（CD）またはコリン補充（CS）飼料を自由に摂取できた。 CD飼料（MP Biomedicals Canada、カタログ番号901387）には、ラードとして20％の脂肪が含まれていた。 CS飼料はCD飼料に0.4%(w/w)の塩化コリンを添加したものである。 マウスはイソフルランで麻酔した後、心臓を穿刺して犠牲にした

2.2. 体重増加、除脂肪体重および脂肪量の測定

体重は毎週測定した。 2.2.体重増加、除脂肪量、脂肪量測定＜397＞＜7422＞体重は毎週測定し、除脂肪量は食餌開始2ヶ月後にEchoMRIを用いて解析した。

2.3. グルコースおよびインスリン耐性試験

グルコース耐性試験：12時間の絶食後、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解した0.5gブドウ糖／kg体重の腹腔内注射（i.p.）をマウスに投与した。 インスリン耐性試験：6時間の絶食後、マウスに1.0単位のインスリン（シグマ）/kg体重をPBSに溶解したものをi.p.注射した。 血中グルコース濃度は、注射前および注射後の指示された時間に尾部出血でグルコメーターにより測定された。

2.4. ミトコンドリア複合体I／II活性の測定＜397＞＜7422＞ミトコンドリア複合体IおよびIIの活性は、ミトコンドリアタンパク質を用いて測定した。 簡単に説明すると、ミトコンドリアタンパク質を単離するために、サンプルを氷上に保ち、10mM Tris-HCl pH7.4中の75mMスクロース、225mMソルビトール、1mM EGTAおよび0.1％脂肪酸フリーウシ血清アルブミンを含む緩衝液でホモジナイズした。 このホモジネートを600×gで15分間遠心分離し、得られた上清をさらに16,200rpmで20分間遠心分離した。 ペレット中のミトコンドリアタンパク質は、20 mM Tris と 25 mM Sucrose (pH7.4) を含むバッファに懸濁し、使用するまで-80℃に保存した。 活性の測定は、分光光度計で5分間、NADH（複合体Iの基質）またはコハク酸（複合体IIの基質）のいずれかの存在下で2，6-ジクロロフェノール-インドフェノール（DCPIP）をユビキノン-1に適宜還元することによる600nmの吸光度の減少として実施した。 この反応は、複合体IIIおよび複合体IVの阻害剤としてアンチマイシンおよびシアン化カリウムの存在下で行われた。 複合体Iの阻害剤であるロテノンも複合体II活性の反応緩衝液に関与していた

2.5. 組織学とイムノブロット

組織学は、肝臓または脂肪パッドをPBS中の10％ホルムアルデヒドに分解し、ルーチンのヘマトキシリンとエオシン染色を行った。 肝臓をホモジナイズし、600×gで遠心分離した後、上清をタンパク質濃度測定（BioRad）し、等量のタンパク質がSDS-PAGEにロードされていることを確認した。 ホルモン感受性リパーゼ（phospho-HSL／total HSL）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、（PEPCK）、アセチル-CoAカルボキシラーゼ（phospho-ACC／total ACC）、およびAMP-活性化タンパク質キナーゼ（phospho-AMPK／total AMPK）に対する一次抗体はすべてCell Signalingから購入したものである。 ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼアイソザイム4（PDK4）、グルカゴン受容体に対する抗体はAbcamから入手したが、サイトカインシグナリング3の抑制因子（SOCS3）およびPGC-1αはサンタクルーズバイオテクノロジーから入手した.Tublinまたはアクチンを標準化のためのローディング対照として用いた。 画像はImageJソフトウェアによって解析された＜6724＞＜9165＞2． 血漿インスリン、グルカゴン測定＜397＞＜7422＞マウス／ラットグルカゴン、インスリンアッセイキット（Meso Scale Discovery社）を用いて、同社の説明書に基づき測定した。

2.7. 統計解析

データは平均値±SDで表示した。 差はstudent’s t-testを用いて評価した。 𝑃<0.05 の値を有意とした。 結果

コリン欠乏食は、摂餌量に影響を与えずに2ヶ月までの体重増加を有意に遅らせた（図1（a））（1日の摂餌量 CDマウス 7.21±1.23 g 対 CSマウス 7.39±1.31 g、𝑃>0.05 ）。 開始時体重は2群間で有意差があった（CDマウス30.42±1.70 g vs CSマウス26.3±2.26 g, 𝑃=0.01）． コリン欠乏は心臓、肝臓、腎臓の重量に影響を与えなかったが（図1（b））、副睾丸および腎周囲脂肪の重量に有意な減少が見られた（図1（c））。 さらに磁気共鳴画像法を用いて解析したところ、コリン欠乏は全身の脂肪量を減少させ、絶対質量で表しても、全身の質量に対する相対割合で表しても、除脂肪量を増加させた（図1(d)）。 また、コリン欠乏は脂肪組織のリンホルモン感受性リパーゼ（酵素の活性化型）の発現を増加させた（図1(e)）。 一方、コリン欠乏は脂肪組織の形態に変化を与えなかった（図1(f)）。

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図1

コリンー欠損食は体重増加を抑制し、脂肪分解能を亢進させる。 8週齢の雄性ob/obマウスにCDまたはCS食を2ヶ月間自由摂取させた。 体重増加（a）、組織重量（b）、副睾丸および腎周囲脂肪重量（c）、脂肪量および除脂肪量（d）が測定された。 脂肪組織におけるphosphoおよびtotal-hormone sensitive lipaseのタンパク質発現をイムノブロットにより測定した（e）。 脂肪パッド切片をH & Eで染色した(f)。 ∗∗CS群と比較した場合、＊＊𝑃<0.01 および＊＊𝑃<0.05 である。

体重に影響するほか、コリン不足は血漿インスリン値には影響しないが、空腹時血糖値（14.3±1.67 対 10.8±1.19, 𝑛=5, 𝑃<0.05 ）およびグルカゴン値（図2（a））も低下させた（図2（b））。 コリン欠乏食を与えたマウスでは、グルコースおよびインスリンの不耐性が有意に改善された（図2（c）-2（d））。 そのメカニズムを調べるために、グルコース酸化の主要な酵素を分析した。 コリン欠乏は、ミトコンドリアのアセチル-CoAの流入を制御するピルビン酸脱水素酵素活性の負の調節因子であるPDK4（図3（a））の肝臓タンパク質発現を低下させ、グルコース利用が促進されることを示唆した。 同様に、肝臓のPGC-1α（PDK4の上流調節因子として有名）およびPEPCK（PGC-1αの下流標的で糖新生の重要酵素）が減少しており（図3（b））、糖新生の減少が示唆された。 さらに、グルコースおよびインスリン不耐性の改善が、肝炎およびミトコンドリア機能の変化と関連しているかどうかを調べた。 炎症促進マーカーであるSOCS3（図3（c））のタンパク質発現やミトコンドリアのクエン酸合成酵素の活性は影響を受けなかった（データ示さず）。 しかし、ミトコンドリア複合体Iの活性はコリン欠乏により有意に低下した（図3(d)）。 興味深いことに、肝グルカゴン受容体のタンパク質発現もコリン欠乏により減少した（図3(e)）。

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図3

コリン投与によるob/obマウスのインスリン感受性改善に関与する分子機構欠損食。 8週齢の雄のob/obマウスにCDまたはCS食を2ヶ月間自由に摂取させた。 PDK4 (a), PEPCK, PGC-1α (b), SOCS3 (c) およびグルカゴン受容体 (e) の肝臓タンパク質発現を免疫ブロッティングにより測定した。 また、ミトコンドリア複合体IおよびIIの活性も測定した（d）。 ∗9660＞＜1087＞＜7422＞耐糖能は改善するものの、コリン欠乏は脂肪肝を悪化させ、組織学的解析と肝トリグリセリド量の増加によって裏付けられた（図4（a））。 コリン欠乏による脂肪肝のメカニズムを理解するために、脂肪酸β酸化と脂肪生成に関与する酵素を調べた。 コリン欠乏は、肝グリセロール-3-ホスホアシルトランスフェラーゼ（GPAT）活性を増加させ（図4（b））、脂肪酸β-酸化の主要酵素であるβ-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ（β-HAD）活性を低下させた（図4（c））から、多くの細胞内脂肪酸は酸化ではなく脂質生合成にチャネルされていることが示された。 この考えは、さらに、肝臓のphospho-AMPKおよびphospho-ACC発現の減少（図4（d））により支持され、その後ACCが活性化され、肝臓の脂肪生成が促進された。

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図4

コリン負荷OB／OBマウスにおける脂肪肝発生に関する分子的機構。欠損食。 8週齢の雄のob/obマウスにCDまたはCS食を2ヶ月間自由に摂取させた。 肝切片をH & E染色プロトコールで染色し、肝トリグリセリド量を測定した(a)。 グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼ（GPAT）（b）およびβ-ヒドロキシルアシル-CoAデヒドロゲナーゼ（β-HAD）（c）活性を測定した。 phospho-AMPKおよびphospho-ACC（d）のタンパク質発現をモニターした（d）。 ∗CS群と比較して0.05であった。 議論

これまでの研究で、我々はコリン補充がPEMT欠損マウスの高脂肪食誘発性肥満およびインスリン抵抗性に関連していることを明らかにした。 最近、我々はコリンによるインスリン抵抗性が野生型マウスだけでなく、PEMT欠損マウスでもコリン特異的であることを明らかにした（Wu and Vance et al.未発表データ）。 今回、我々はコリン欠乏がob/obマウスに与える影響について検討した。 その結果、コリン欠乏による5つの新規作用が証明された。 (1）脂肪分解活性の上昇、（2）グルコース酸化の改善、（3）肝脂肪酸酸化の減少、（4）肝グルカゴン受容体の発現低下、（5）肝ミトコンドリア複合体II活性の低下。

4.1. コリン欠乏は体重増加を抑制する

コリン欠乏はPemt-/-マウスの高脂肪食誘発性肥満やob/obマウスの体重増加を有意に抑制する。 しかし、Raubenheimerらは、コリン欠乏は体重増加や脂肪組織の重量に影響を与えないことを報告した 。 この2つの研究の違いは、動物モデルと給餌プロトコルの違いに起因している可能性がある。 Raubenheimerの研究では、C57Bl/6マウスに高脂肪食または低脂肪食を8週間与えたが、最後の4週間はCDまたはCS食を与えただけであった。 我々のob/obマウスは、高脂肪のCD食またはCS食を8週間摂取させた。 文献上、体重増加や肝（および筋）インスリン感受性などの代謝研究において、雌雄両方のob/obマウスが広く使用されており、有意な性差の影響は報告されていない。 本研究では、雄のob/obマウスのみを用いた。

今回の研究は、コリンが遺伝子由来の肥満も調節できることを実証している。 コリン欠乏は食餌量に影響を与えなかったので、脂肪分解活性の増加（活性ホルモン感受性リパーゼの発現の増強）が脂肪量と体重増加の減少を説明する可能性がある。 さらに、コリン不足がエネルギー消費を促進する可能性や、体重増加の減少に寄与する潜在的な要因である褐色脂肪組織におけるUCP1や骨格筋におけるUCP2/UCP3の発現を高める可能性も排除できない.

4.2. コリン欠乏は耐糖能を改善する

コリン補給はマウスで高脂肪食によるインスリン抵抗性と関連するが、コリン欠乏はob/obマウスの耐糖能を改善した。 これは、CD高脂肪食を与えたC57Bl/6マウスがコリン補充高脂肪食と比較してインスリンレベルが低下し、耐糖能が改善したというRaubenheimerの研究とも一致する 。 血漿グルカゴンが高いのは、通常2型糖尿病患者である。 ラットにコリンを注射すると、血漿インスリンとグルカゴンレベルの両方が上昇した。 逆に、コリン欠乏は血漿中のグルカゴンを減少させ、グルカゴン受容体の発現を減少させた。 近年、2型糖尿病の治療薬としてグルカゴン受容体拮抗薬が提案されているので、コリン欠乏食のob/obマウスでは、グルカゴン受容体のタンパク質発現が低下していることが、耐糖能の改善をある程度説明できると思われる。 肝 PGC-1α の発現低下は、PEPCK および PDK4 のダウンレギュレーションと同時に起こり、グルコース産生の低下とグルコース酸化の亢進を示唆し ている。 また、β-HADH活性の低下は、脂肪酸酸化の減少を示唆した。 これらの過程は、ミトコンドリア複合体II活性の低下を伴っており、これはミトコンドリア酸化ストレスの減少に対する代償反応を反映している可能性がある。 したがって、CDによる耐糖能の改善は、肝グルコース出力の低下とグルコース利用の増加によるものであった。 これは、肝グルカゴン受容体の抑制により、アデニル酸シクラーゼを介してAMPKを制御し、それによってPGC-1αおよびその下流の標的であるPEPCKやPDK4、さらには肝ミトコンドリア電子輸送能を調節することによって起こる可能性がある。 このように、グルカゴン受容体が糖尿病の新たな治療ターゲットとなり得るかどうかについては、さらなる検討が必要である。

4.3. 脂肪肝とインスリン抵抗性の断絶

脂肪肝は、肥満とは無関係に2型糖尿病を予測する因子であることが示されている。 細胞内脂肪酸の増加は、肝インスリン抵抗性の原因として考えられている。 本研究では、コリン欠乏により脂肪肝が増悪し、β-hydroxyacyl CoA dehydrogenase活性の低下とglycerol palmitoyl-acyl transferase活性の上昇が観察され、コリンが脂肪酸代謝を調節する役割を持つことが示唆された。 したがって、脂肪酸の肝トリグリセリド貯蔵への再方向付けは、肝細胞内脂肪酸濃度を低下させる初期の保護メカニズムである可能性がある。 しかし、長期的なコリン欠乏は、肝脂肪症、神経管欠損のリスク、癌のリスク、記憶喪失と関連しており、肥満やインスリン抵抗性の長期的な治療戦略としてコリン欠乏食を使用することは制限される可能性がある

結論として、コリン不足はob/obマウスの体重増加防止とグルコース耐性改善を可能にした。 高コリン含有食品の摂取を適度に制限することで、肥満、糖尿病予備軍、糖尿病患者に効果が期待できる。 この結果は、新しい治療法の可能性を示唆している。

略語

コリン欠損

SOSS3：

PC:	Phosphatidylcholine
PEMT:	Phosphatidylethanolamine N-methyltransferase
CD.PEMT:Phosphatidyltholine
PC:PHITSHITSHITDS:PHITSHITDSHITDSHITDSHITDSHITDSHITDSHITDSHITDSHITDS	コリン不足
CS:	コリン補給
HSL:	ホルモン感受性リパーゼ
PEPCK.K
PECC>
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ
ACC:	アセチルCoAカルボキシラーゼ
AMPK:	AMK（活性型タンパク質キナーゼ）
PDK4.AMP
PDK4:	ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼアイソザイム4
SOCS3：	サイトカイン情報伝達抑制3
GPAT：	グリセロール3リン酸転移酵素.SOCS3：
ピルビン酸デヒドロゲン酸キナーゼアイソザイム4
SOPHER OF ITOICA

著者らの貢献

G. WuとL. Zhangは平等に貢献した。

著者らの開示

著者らは利益相反を宣言しない。

謝辞

この仕事はカナダ保健研究所からの助成金（MOP 89793）によって支援されています。