キメラとは、ギリシャ神話に登場するライオン、ヤギ、ヘビの合成生物であり、このキメラは「キレイモ」と呼ばれる。 造血細胞移植における「キメラ」という言葉は、この「混血」という考え方に由来しており、遺伝的に異なる組織の移植を受けた人のことを指す。
DNAによるキメラ検査（生着率解析）は、ヒトの身元確認によく用いられる方法を採用しており、ショートタンデムリピート（STR）遺伝子座と呼ばれるゲノム多型の解析により達成される。 これらの遺伝子座は、個別の遺伝子座の中で可変回数繰り返されるコアDNA配列で構成されています。 STRという用語は、マイクロサテライトとも呼ばれ、タンデムに繰り返されるコアDNA配列の塩基対の数に関するもので、長さは2-8塩基対の範囲である。 これらの遺伝子座は、個人間で長さが異なる対立遺伝子を示し、メンデルの共優性形質として遺伝する。 STR遺伝子座はヒトゲノム全体に存在し、25以上の対立遺伝子を持つ遺伝子座もある。
STR遺伝子座の保存された隣接領域内のDNA配列情報は、STRに対するオリゴヌクレオチドプライマー対を作るために使用される。 これらのプライマーは、検査サンプルのPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅に使用される。 この技術により、STR配列は10億回も増幅され、電気泳動ゲルまたはキャピラリー電気泳動（CE）で分離可能な物質が得られる。 遺伝子型判定は、DNA断片の大きさを評価することによって行われる。
PCRベースのSTR/CEシステムには、他の分析方法と比較していくつかの利点がある。 複数のSTR遺伝子座の増幅を1本のチューブで組み合わせる（multiplexed）ことができ、1回の反応で最大16の遺伝子座を分析することができる。 微量のDNAを必要とするため、細胞数の少ない試料でも使用でき、STR対立遺伝子のサイズが小さいため、劣化したDNA試料でも使用可能である。 また、デジタルデータにより解析や保存が容易になり、CEプロセスは迅速かつコスト効率に優れています。 STR遺伝子座のPCR増幅および解析は、幹細胞移植の環境における生着状態を評価するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供する。
現在用いられている技術は、重複しないサイズ範囲の増幅断片を示す5または6の遺伝子座の3セットに細分化された16遺伝子座の共増幅および3色検出を可能にする。 PCR増幅後、キャピラリー電気泳動（CE）システムで処理される。
データ解析は、フラグメント解析ソフトウェアによって促進されます。このソフトウェアは、サンプルとともに実行される内部レーン標準を使用してDNAフラグメントのサイズを決め、CE実行に含まれるSTRアレルラダーとの比較によって遺伝子型を割り当てます。 これにより、ドナーと移植レシピエントの異なるSTR遺伝子型プロファイルが得られる。 これらの個体間で多型（すなわち情報伝達性）であるSTR遺伝子座は、移植後のサンプル中のレシピエントとドナーのDNAの相対量を評価するために使用される。
検査されるサンプルは、骨髄、末梢血、固形腫瘍、表皮組織、毛包、頬のスワブ、分画細胞サブセットなどのDNAを含むあらゆる物質からのものでもよい。 サンプルのPCR増幅は通常2ng以下のゲノムDNA（約300個の細胞に相当）で行われるため、この方法によるキメラ検査は、移植片不全、重度の白血球減少症、造血細胞サブセット分画からの患者に対しても正常に行うことができる。 STR解析は、臍帯血ドナーの二重移植や異なるドナーからの二次移植を受けた患者を含む造血細胞移植を受けた患者の生着状況の評価、一卵性双生児の遺伝的同一性の確認、重症複合免疫不全（SCID）と診断された患者の胎内由来の母細胞移植の検出に使用されています。 STR/CE分析は、迅速で信頼性が高く、正確で再現性の高い方法です。
アッセイの制限事項
- 堅牢なPCR増幅を可能にするために、十分なDNAが検査サンプルから分離されなければなりません。 移植片不全のレシピエントやフローサイトメトリーによる血統特異的な白血球サブセットのような、細胞数の少ないサンプルを扱うためのDNA分離方法が利用可能でなければなりません。 サンプルはUV分光光度計OD260で定量できないほど低濃度である場合があります。 5,000から30,000の単離細胞からのDNAサンプルは、確実に許容できる増幅率を提供します。
- 市販のキットでは、非血縁ドナーにおいて、多くのSTR遺伝子座がドナーとレシピエントの両方に対して有益な対立遺伝子を持っている。 しかし、血縁ドナーの移植ペアでは、有益なSTR遺伝子座の数は3つ程度に制限されるかもしれない。 5560>
- 悪性疾患の患者は、特定のSTR遺伝子座に影響を与えるクローン性突然変異を有している可能性がある。 移植前の患者サンプルと移植後のサンプルで同定された対立遺伝子を比較すると、1つまたは複数のSTR遺伝子座で患者の対立遺伝子が欠落している可能性がある。 まれに、移植前標本には存在しなかった特定の遺伝子座で、余分な患者STR対立遺伝子が検出されることがある。 ほとんどの場合、これらの異常は染色体転座に起因すると思われる。 また、PCRプライマーが配置されているSTR保存フランキング配列内の変異の結果である可能性もある。 5560>
- 患者の移植前の細胞が入手できない場合、頬のスワブ、皮膚の生検、毛根などのサンプルが移植後に採取されることがある。
- 本アッセイは微小残存疾患の検出を目的としたものではありません。
造血細胞移植におけるキメラ検査の臨床適応
末梢血及び/又は骨髄における白血球のドナー/レシピエント起源に関する移植後のルーチンの文書化。 移植の文書化には、CD3陽性T細胞やCD33陽性骨髄系細胞など、系統特異的な細胞サブセットの検査が含まれる場合がある。
骨髄機能が不十分な患者においてドナー/レシピエント細胞を評価すること。
再発または新たな悪性腫瘍がレシピエント細胞またはドナー細胞に由来するのか定義する。
拒絶反応と再発悪性腫瘍の予後リスクを評価する。
疾患再発患者またはドナーリンパ球注入（DLI）前に移植後のドナー細胞の残存を文書化する。
二次移植の候補であるレシピエントにおいて移植片拒絶が起きているかどうかを評価する。
異なるドナーによる二次移植または二重臍帯血単位による移植を受けたレシピエントのドナー細胞の由来を鑑別する。
重症複合免疫不全症（SCID）と診断された患者の母体由来細胞の検出
一卵性双生児の遺伝子識別
よくある質問
Question: 複数のドナーはどのように解析されますか。
Answer 患者と各ドナーについて、少なくとも1つの固有のSTR対立遺伝子を示すSTR遺伝子座を同定することが重要である。 なぜ母親の生着が検査されるのですか？ 重症複合型免疫不全症（SCID）と診断された患者さんは、胎内で母親由来の造血細胞が移植された可能性があります。 特定の系統特異的な細胞サブセット（特にCD3陽性細胞）は、主にあるいは完全に母体由来である可能性があります。 完全」キメリズムと「混合」キメリズムの違いは何ですか？ 「完全」キメリズムとは、移植後の造血細胞がすべてドナー由来の表現型を示す患者を指します。
「混合」キメリズムとは、移植後の造血細胞が患者とドナーの表現型の混合を示す患者を指します。
Question レシピエントベースラインサンプルが入手できない場合はどうすればよいですか。 頬拭き、毛根、皮膚生検のいずれかをレシピエントベースラインサンプルとして使用することができます。 頬拭きサンプルにはドナーの細胞が大量に含まれている可能性があるため、頬拭きサンプルの使用には注意が必要です。
Question: ドナーのベースライン・サンプルが入手できない場合はどうすればよいですか。 ドナーが生存している場合、新たに血液サンプルを採取してください。 ドナーが生存していない場合、移植後のサンプルを移植前のベースラインと比較し、検出されたものの患者由来ではないSTR対立遺伝子を特定する必要があります
Question なぜHLAは移植を監視するための実行可能な手段ではないのでしょうか？
回答 移植ドナーは、レシピエントとできるだけ一致するように選ばれます。 一致した場合は、レシピエントとドナーを区別するHLAマーカーはなく、不一致の場合は1つか2つだけです。 さらに、この目的のためには、HLA不一致の対立遺伝子をモニターするよりも、他の技術の方が感度が高いことが多く、結果として、他の遺伝子座を使用して独自のプロファイルを提供することになります。 情報量の多いSTR遺伝子座とは何か。 レシピエントまたはドナーに固有の対立遺伝子を少なくとも1つ持つ遺伝子座である。 キメラの計算に用いるには、両者に固有の対立遺伝子を持たなければなりません。 血縁のないドナーが移植された場合は、多くの情報提供遺伝子座が存在しますが、適合した兄弟姉妹が移植された場合は、ほとんど存在しません。 各遺伝子座の対立遺伝子の増幅効率は異なるので、精度を高めるためには、複数の遺伝子座から平均値または中央値を得ることが望ましい。 個々の遺伝子座の結果は確実に再現されるので、1つの遺伝子座でも連続したサンプルのトレンドに使用することができます。 一部の増幅パネルに含まれる「amelogenin」遺伝子座とは何ですか。
回答 アメロゲニン遺伝子は、X染色体およびY染色体に存在します。 STRではありませんが、それぞれの染色体上に異なるサイズの産物を示します。 そのため、性別の判定に有用です。 X/Y鑑別が盛んな法医学分野をターゲットとした市販キットベンダーのプライマーパネルに含まれる。 また、性別を一致させた幹細胞移植後のサンプルを評価する際にも有用です。
Question: STRキメリズム解析はジェノタイピングとどう違うのですか？ 「遺伝子型」とは、特定の遺伝子座に存在する特定の対立遺伝子を指します。 Genotypingは、キメリズム試験において、レシピエントとドナーのプロファイルを確立するために行われます。 幹細胞移植後にキメリズム解析が行われる場合、レシピエントとドナーの遺伝子型プロファイルを移植後のサンプルプロファイルと比較し、各成分がどの程度存在するのかを評価するのです。 法医学者は、遺伝子型を利用して、刑事事件の証拠の出所を特定したり、容疑者として考慮されない人物を排除したりしています。 また、「ジョン・ドウ」事件や大規模災害時の遺体の特定も可能です。
Literature Cited/Recommended Reading
Bryant E, Martin PJ. 造血細胞移植後の移植の記録とキメラの特徴付け。 で。 Forman S, Blune K, Thomas ED, eds. 造血細胞移植。 第2版。
Bultler J. 法医学的DNAタイピング. エルゼビアアカデミック出版.
Bultler J. Forensic DNA typing.