米国およびカナダのお客様は、こちらからCTABベースのSYNERGY™ 2.0 Plant DNA Extraction Kitの無料サンプルを請求できます。
異なる植物種間の生化学反応は極端で、植物組織からのDNA分離は非常に難しい場合があります。 異なる種から採取された同じ種類の組織が通常同様の特性を持つ動物組織とは異なり、植物は代謝物や構造的な生体分子のレベルが異なることがあります。 多糖類とポリフェノールは、植物生体分子の中でも種によって大きく異なり、DNAを分離する際に非常に問題となるものである。 汚染された多糖類やポリフェノールは、分離後のDNAの操作に支障をきたします。
植物のDNA調製物から多糖類やポリフェノールを効果的に除去する方法が利用可能です。 カチオン性洗浄剤であるCTAB（cetyl trimethylammonium bromide）の使用は精製中の多糖類の分離を容易にし、ポリビニルピロリドンなどの添加物はポリフェノールの除去を助けることが可能である。 CTABを用いたDNA精製の1つの方法は、多糖類とDNAが塩化ナトリウムの濃度によってCTABに対する溶解度が異なることを利用するものである。 塩濃度が高いと多糖類は不溶性になり、低いとDNAは不溶性になる。 そのため、CTABを含むライセートの塩濃度を調整することで、多糖類とDNAの沈殿に差をつけることができる。
ポリフェノールは、フェノール環（例えば、タンニン）を二つ以上含む化合物で、DNAと非常に効率よく結合する構造をしている。 植物中に天然に存在するが、植物に組織の損傷（褐変）が生じた場合にも生成される。 植物組織をホモジナイズすると、遊離したポリフェノールオキシダーゼによって、ポリフェノールが合成される。 ポリビニルピロリドンを添加すると、ポリフェノールが結合してDNAとフェノール環の相互作用を防ぐことができる。
CTAB ベースのプロトコルは非常にうまくいく傾向があるが、1つの大きな欠点は、DNAから有機可溶性分子を分離するためにクロロホルム抽出が日常的に使用されているということである。 クロロホルムには発がん性があるため、多くの研究機関がその使用に難色を示している。 そこで、クロロホルムを使用しない代替法がOPSダイアグノスティックス社によって開発されました。この方法は、Synergy™ Plant DNA Extraction Kitのページでご覧いただけます。 2％ cetyl trimethyl ammonium bromide、1％ polyvinyl pyrrolidone、100 mM Tris-HCl、1.4 M NaCl、20 mM EDTA、またはCTAB Extraction Buffer
Method
植物サンプルは、液体窒素で冷却した後、乳鉢と乳棒で組織を低温粉砕することによって調製することができます。 凍結乾燥した植物は、室温で粉砕することができる。 いずれの場合も、DNA抽出には微粉末が最適です。
- ホモジナイズした組織100 mgに対して、500 µlのCTAB Extraction Bufferを使用します。 混合し、十分にボルテックスします。 ホモジネートを60℃のバスに移し、30分放置します。
- インキュベーション後、ホモジネートを14,000×gで5分間遠心分離します。
- 上清を新しいチューブに移します。 5 µlのRNase solution Aを加え、37℃で20分間インキュベートする
- 等量のクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を添加する。 ボルテックスで5秒後、14,000×gで1分間遠心分離し、相を分離する。 上層の水相を新しいチューブに移す。 上相が透明になるまで、この抽出を繰り返す。
- 上層の水相を新しいチューブに移します。 0.7容量の冷イソプロパノールを加えてDNAを沈殿させ、-20℃で15分間インキュベートします。
- 14,000×gで10分間遠心分離する。 ペレットを崩さず上清を捨て、その後500μlの氷冷70%エタノールで洗浄する。 エタノールをデカントする。 スピードバックを用いて乾燥させ、残留エタノールを除去する。
- アルコールを除去するのに十分な時間、ペレットを乾燥させますが、DNAは完全に乾燥させません。 20 µl TE buffer (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA)にDNAを溶かす。 ペレットを溶解させるために、加温が必要な場合があります。
オプションプロトコル：
シリカスピンカラムを使用することにより、より高品質のDNAを得ることができます。 オプションのプロトコルはこちら
。