Integrin CD11b regulates macrophage polarization
VCAM receptor integrin α4β1は骨髄から腫瘍微細環境まで髄膜細胞の移動を促進し、免疫抑制、血管形成、腫瘍進行の刺激になると以前に報告しました2, 13,14,15. 一方、ICAM-1とフィブリノーゲンの骨髄系細胞インテグリン受容体であるCD11b (αMβ2) は、Itgam-/-マウスのCD11bグローバル欠失により、循環中の骨髄系細胞の数にも腫瘍に動員される細胞の数にも影響を及ぼさないことが分かった（補足図1；補足図2a-d）。 しかし、驚くべきことに、インテグリンCD11bがマクロファージの極性を制御する上で必須の役割を担っていることがわかった。 Itgam-/-マクロファージは、WTマクロファージと比較して、基礎刺激、IL-4刺激、IFNγ/LPS刺激のいずれにおいても、免疫抑制性の遺伝子とタンパク質の発現が増強され、炎症性の遺伝子とタンパク質発現が強く抑制されていた（図1a, 付録図2e-f). CD11bがin vivoでもマクロファージの極性を制御しているかどうかを調べるために、Itgam-/-およびWTマウスで増殖したLLC腫瘍からF4/80 + TAMを分離して特性評価を行った。 その結果、Itgam-/-TAMはWT TAMと比較して、Arg1, Tgfb, Il10, Il6, Pdgfbなどの免疫抑制や血管新生に関連するmRNAの発現量が著しく高く、Ifng, Nos2, Tnfaなどの免疫刺激に関わる遺伝子の発現量が著しく低いことがわかった（Fig. 2481>
CD11b ligationは炎症性マクロファージのシグナルを促進させる。 a-f WT（白棒）またはItgam-/-（水色棒）マウスの骨髄由来マクロファージ（BMDM）における炎症性・抗炎症性サイトカインの相対的mRNA発現（n = 2-8）。 b LLC肺癌腫瘍を持つWT（白棒）およびItgam-/-（水色棒）マウスの腫瘍関連マクロファージ（TAM）（n = 2-4）；cItgam-/-およびItgamまたは非サイレンシングsiRNA導入マクロファージ（n = 2-4）； inset: トランスフェクトしたマクロファージにおけるCD11bの細胞表面発現レベル；d 非特異的（IgG）または抗CD11b抗体存在下のWTマクロファージ（n = 3）、e ICAM-1、VCAM-1またはBSAコートプレート（Susp）に付着したマウスマクロファージ（n = 3）、f ICAM-1またはBSAコートプレート（Susp）に付着したヒトマクロファージ（n = 3）。 g IFNγ＋LPSで刺激したWTおよびItgam-/-マクロファージにおけるphosphoSer536および総p65 NFκB RelAのイムノブロッティング；WT（白棒）およびItgam-/-（青棒）BMDMにおける相対pSer536発現の定量化グラフ。 h, i h骨髄由来およびi腫瘍由来のWTまたはItgam-/-マクロファージを養子にしたWTおよびItgam-/-マウスにおけるLLC腫瘍増殖率。 j WT（白棒）およびItgam-/-（水色棒）マウスのLLC腫瘍全体におけるサイトカインの相対的mRNA発現（n = 3）。 k WT（黒丸）およびItgam-/-（水色）マウスにおける肺LLC腫瘍（n = 17）、B16メラノーマ（n = 9）および自家PyMT乳腺腫瘍（n = 10-14）重量。 l WT（黒丸）対 Itgam I332G knockin mouse（水色）において増殖したLLC腫瘍の重量および体積（n = 6-7）. エラーバーはsemを示す。 「p < 0.05は、a-gとjについてはStudentのt-testにより、h, i, k, lについてはAnova with Tukey post-hoc testにより決定した統計的有意性を示す。 ソースデータは、ソースデータファイル
重要なことは、in vitro培養マクロファージにおけるCD11bの一過性のsiRNA媒介ノックダウンが、CD11b欠失と同等の効果、免疫抑制遺伝子発現上昇および免疫刺激遺伝子発現低下（図1c）であり、CD11bの一時的損失でさえマクロファージの免疫抑制遺伝子発現を制御することを示したことである。 CD11bの発現または機能がマクロファージ遺伝子発現を制御しているかどうかを調べるために、マクロファージmRNA発現に対する阻害性CD11b抗体の効果を調べた。 抗CD11b中和抗体によるマウスマクロファージのCD11bを介したICAM-1コート基質への接着の阻害は、マクロファージにおける免疫抑制性mRNAの発現をも誘導した（図1d）。 同様に、インテグリンα4β1基質であるVCAM-1へのマクロファージの接着や浮遊培養による接着の喪失は、マウスやヒトの免疫抑制性転写を促進し、ICAM-1コーティング表面への接着は免疫賦活性転写を促進した（Fig. Itgam-/-マクロファージで炎症性サイトカインが発現しなくなったことから、CD11bがNFκBなどの炎症性転写因子の活性化を制御している可能性が示唆された。 Itgam-/-マクロファージは、WTマクロファージと比較して、LPS刺激に対するNFκBセリン536リン酸化（活性化の低下の指標19）が低下していることがわかり、CD11bがNFκB活性化に関与していることが示唆された（図1g）。 他の研究では、LPSとインテグリンβ2細胞外ドメインの直接的な相互作用を通じて、CD11bが単球や樹状細胞の炎症反応の促進に関与していることが示されている20,21ので、我々の結果は、CD11b活性化とシグナル伝達がin vitroおよびin vivoでのマクロファージ極性制御において重要な役割を果たすことを示すものであった。
Macrophage CD11b regulates tumor growth
我々のデータは、Itgam-/-骨髄由来および腫瘍関連マクロファージがWTマクロファージよりも免疫抑制性の転写プロフィールを示すことを示している。 この違いが腫瘍増殖に影響するかどうかを調べるため、WTまたはItgam-/-の骨髄由来または腫瘍関連マクロファージと腫瘍細胞をレシピエントであるWTまたはItgam-/-マウスに養子縁組移植を行った。 以前、我々は、養子移入された免疫抑制性BMDMやTAMが腫瘍の成長を刺激することを証明した9,10。 驚くべきことに、骨髄由来のItgam-/-マクロファージ（図1h）および腫瘍由来のItgam-/-マクロファージ（図1i）は、WTおよびItgam-/-マウスの両方でWTマクロファージと比較して腫瘍増殖を強力に促進した。 Itgam-/-マクロファージは免疫抑制性の転写プロファイルを示し（図1b）、Itgam-/-マウス由来の腫瘍は全体的に免疫抑制性の転写プロファイルを示す（図1j）ことから、これらのデータはCD11bの発現または活性化が腫瘍全体の増殖に影響を与える可能性を示唆している。 実際、皮下（LLC）、同所（メラノーマ）、自家（PyMT）腫瘍は、WTマウスよりもItgam-/-マウスの方がより積極的に成長することが分かった（図1k）。 Itgam-/-マウスはWTマウスに比べ、腫瘍内でCD4 + Foxp3 + Tregが大幅に増加し、CD8 + T細胞が減少したことから（補足図3a-b）、我々の研究はCD11bが腫瘍における免疫反応全体を制御する上で重要な役割を果たしているという結論を支持している。
先行研究はCD11b分子のイソロイシン332が接着受容体の活性化と形を制御するアロステリックスイッチとして働いていると示した22。 CD11bの活性化が腫瘍の発生を制御しているかどうかを調べるため、マウスItgam遺伝子にI332G点変異を導入し、構成的に活性化したCD11bノックインマウス系統（C57BL/6 ITGAMI332G）を作製した。 I332Gノックインマウスは、単球、顆粒球ともに細胞表面CD11bを正常レベルで発現し、全血液細胞レベルも正常レベルを示す（補足図3c-d）。 これらのマウスの骨髄由来マクロファージを用いたin vitro接着アッセイでは、I332G細胞は構成的に活性なCD11bを発現していることが示された（補足図3e）。 重要なことは、I332G ItgamノックインマウスはLLC腫瘍の成長を有意に減少させたことである（図1k）。 このように、CD11b欠失は抗炎症性マクロファージの極性を刺激し、CD8+ T細胞の動員を阻害して腫瘍の成長を促進するが、CD11b活性化は腫瘍の成長を強力に阻害することが明らかになった。 これらの研究は、マクロファージCD11bが腫瘍の成長を制御する上で重要な機能的役割を果たすことを示している。
Immune suppressive signals inhibit CD11b expression
腫瘍微小環境に関わるシグナルがCD11b発現を変え、その後骨髄細胞の極性に影響を与えるかどうかを調べるために、骨髄由来マクロファージの細胞表面CD11b発現に対するマクロファージ媒体（mCSF-, IL-4- and IFNγ/LPS ）の影響を評価した。 免疫抑制サイトカインIL-4はCD11bの発現を低下させるが、炎症性刺激IFNγ/LPSはmCSF刺激マクロファージで発現したレベルと比較してCD11bの表面発現を増強した（補足図4a-b）。 さらに、免疫抑制因子TGFβは、IL-10ではなく、CD11bの表面発現を抑制した（補足図4c）。TGFβ、IL-4および腫瘍細胞調整培地（TCM）もそれぞれCd11b mRNAの発現を抑制した（補足図4d）。 重要なことは、TGFβとTCMはCD11bの細胞表面発現を低下させ、免疫抑制性転写を刺激する一方で、TGFβR1阻害剤SB525334によって逆転される方法で免疫刺激性転写を抑制した（補足図4e-g）。 これらのデータは、腫瘍の微小環境におけるTGFβなどのサイトカインがCD11bの発現または活性化を抑制し、それによって免疫抑制性マクロファージの極性を促進することを示唆している。
Macrophage CD11b regulates blood vessel stability
マクロファージは免疫反応のみならず、血管新生や脱皮を制御し、血管新生の際に内皮細胞や血管平滑筋／pericytesをそれぞれ制御する成長因子であるVEGF-AやPDGF-BBなどのサイトカインを発現する2． 腫瘍の血管は、支持する周皮細胞や平滑筋細胞を欠いた単一の内皮層からなることが多い。これらの血管は、腫瘍では正常組織よりも数が多いが、異常な形成で灌流が不十分である。 一方、PDGFとVEGFの比率が高い腫瘍では、血管は間葉系細胞である周皮細胞によって裏打ちされ、血管を安定化させ、腫瘍の灌流を促進します23,24,25,26,27。 これらの腫瘍は、PDGF/VEGF比が低い腫瘍よりも急速に成長するが、腫瘍の灌流が良いため、化学療法や免疫療法にも良く反応する24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36。 Itgam-/-マクロファージは高いPDGF遺伝子発現と低いVEGF遺伝子発現を示したので（図1a、b）、Itgam-/-とWT腫瘍の血管発達のパターンを検討した。 WTおよびItgam-/-マウスのLLCおよびPyMT腫瘍における血管パターンの評価は、Itgam-/-腫瘍はWT腫瘍に比べて内腔が広く、分岐点/フィールドが少ない、長い血管を示した（図2a、b；補足図5a）。 Itgam-/-腫瘍は、Desmin+、NG2+、SMA+の周皮細胞／平滑筋細胞で覆われた血管がWT腫瘍よりも多かった（図2a-c；補図5b）。 したがって、Itgam-/-マウスでは、WTマウスに比べてこれらの血管の透過性が低く、血管内FITC-デキストランの腫瘍実質への漏出が少なかった（図2a-d）。 これらのデータは、インテグリンCD11bが血管の成熟を制御する役割を担っていることを示唆している。 腫瘍では、VEGF-AではなくPDGF-BBの遺伝子発現が強く亢進していることがわかった（図2e；補足図5c）。 重要なことは、Itgam-/-腫瘍および腫瘍由来マクロファージにおいて、PDGF-BBタンパク質の発現もWT腫瘍と比較して上昇したことである（図2f）。 これらのデータは、マクロファージCD11bが高レベルのPDGFの構成的発現を通じて腫瘍の血管新生を制御していることを示唆している
新生血管におけるCD11bの役割に関するこれらの観察を裏付けるものとして、Itgam-/-マウスがよく発達した網膜血管叢を示した（図2a）。 2g, Isolectin B+、緑）、WTマウスは網膜血管が未発達で生後1日目から9日目にかけて徐々に拡張していくのに比べ、出生時（P1）には網膜血管叢が発達していることがわかった。 Itgam-/-マウスでは、生後1日目から生後9日目までの表在血管叢がWT新生児よりも発達していた（Fig.2g）。 この結果は、マクロファージとCD11bが正常な血管のパターニングの制御に重要な役割を果たしていることを示している。
Itgam-/-マウスの血管成熟と腫瘍成長の亢進にPDGF-BBの上昇が関与しているかどうかを調べるために、PDGF-BB受容体のPDGFR1を阻害するイマチニブをLLC腫瘍を持つWTとItgam-/-マウスで投与した。 イマチニブ投与により、Itgam-/-マウスで観察される腫瘍増殖の亢進が抑制された（図2h, i）。 また、Itgam-/-マウスの血管密度を増加させ、血管の正常化を抑制した（図2h,i）。
CD11b regulates Let7a and c-Myc expression
CD11b may control anti-inflammatory macrophage polarization through activation of transcription factors such as Stat3, which can promote expression of immune suppressive and pro-angiogenic factors such as Arginase 1, Myc and VEGF37, 38, 39.これらの結果は、PDGF-BB発現制御を介してインテグリンCD11bが血管発達を調節するという概念を裏付けるものである。 Itgam-/-マクロファージは、構成的にリン酸化されたStat3を示す（図3a挿入部）。Itgam-/-マクロファージにおける高レベルの免疫抑制因子発現は、Stat3阻害剤5,15-DPPで処理するとWTマクロファージレベルまで減少した（図3a）。 しかし、驚くべきことに、Stat3阻害はItgam-/-マクロファージで観察される高レベルのIl6発現には影響を与えなかった（Fig.3a）。 重要なのは、IL-6はStat338を直接活性化できることである。 IL-6は、Itgam-/-マクロファージで観察されたのと同じパターンの免疫抑制性分極をマウスやヒトの骨髄系細胞やマクロファージで促進することがわかった（図3b）。 これらの結果は、IL6がItgam-/-マクロファージで観察される構成的な免疫抑制性極性を駆動している可能性を示唆している。 この概念を支持するように、IL6ノックダウンによりItgam-/-マクロファージにおける構成的なPdgfbの発現が減少した（図3c）。 TAMは腫瘍におけるIl6の主要な発現源であるので15、これらの結果は、CD11bがIl6の骨髄系細胞転写の制御を通じて、部分的に免疫抑制の自然なブレーキとして機能していることを示唆している。 a Stat3阻害剤5,15 DPPとインキュベートしたWT（白棒）およびItgam-/-（青棒）マクロファージにおける炎症誘発性および抗炎症性因子の相対的mRNA発現；挿入図はWTおよびItgam-/-マクロファージ（n = 2-3）におけるStat3リン酸化。 b IL6刺激ヒト（白棒）およびマウス（水色棒）骨髄由来マクロファージおよびマウス全骨髄由来骨髄細胞（青棒）における炎症性および抗炎症性因子の相対的mRNA発現（n = 3）; p < 0.05 ただし、以下の例外あり：mBMM (Ifng, Il12b); mCD11b+ (Arg1, Pdgfb, Il12b および Il1b)． hBMM (Arg1, Ifng, Il1b). c 非サイレンシング（白棒）またはIl6（青棒）siRNAを導入したWTおよびItgam-/-細胞における相対的Il6およびPdgfb mRNA発現 (n = 3). d 非サイレンシング（白い棒）またはItgam（青い棒）siRNAで形質転換したマウスマクロファージ、コントロールIgG（白い棒）または中和抗CD11b（青い棒）抗体でインキュベートしたマクロファージ、WT（白い棒）またはItgam-/-（青い棒）マクロファージ（n=3）における相対的Let7aの発現。 e ICAM-1上に播種したWTマウスCD11b+細胞（青実線）または浮遊状態で維持した（黒点線）におけるLet7a（左）およびIl6（右）発現のタイムコース（n = 3） f ICAM-1に接着したヒトマクロファージ（青）または浮遊状態で維持した（白）（n = 3）における miRNA Let7a および Il6 の相対的な発現。 g コントロール（白棒）、プレ-miRNA Let7a（シアン棒）または抗miRNA Let7a（青棒）で形質転換したWTおよびItgam-/-BMMにおける炎症性因子の相対的mRNA発現（n=3）。 h コントロール（白棒）または抗miRNA Let7a（青棒）で形質転換したWT BMMにおける相対的PdgfbおよびVegfa発現（n = 3） i IL-4 またはIFNγ+LPS刺激WT（黒線）またはItgam-/-（青線）マクロファージにおけるc-Myc発現時間経過（n = 3） i iMMはItgam-/-マクロファージ（白棒）またはIL-4（黒線）で刺激され、VegfaはIFNγ+LPS刺激（青棒）またはIL-3（白棒）で刺激された。 j WTおよびItgam-/-マクロファージにおけるc-Myc発現とpSer62mycリン酸化のタイムコース。 k ベースライン、IL-4、IL-4+c-myc阻害剤処理WTおよびItgam-/-マクロファージにおけるmiRNA Let7a（白棒）, Let7d（青棒）, Let7f（シアン棒）の相対mRNA発現 (n = 3)。 l c-Myc阻害剤10058-F4で処理した（青棒）または処理しない（白棒）IL-4刺激WT（白棒）およびItgam-/-マクロファージにおけるIL6、Arg1およびPdgfbの相対的mRNA発現量。 エラーバーはsemを示す。 「n “は生物学的複製を示す。 *p < 0.05は、a、d-fについてはスチューデントのt検定、b、g、kについてはTukeyのポストホック検定を伴うAnovaによって決定された統計的有意性を示す。 ソースデータはソースデータファイル
Let7 family of microRNAs can controls Il6 expression in tumor and inflammatory cells40,41. microRNAは、RNAの翻訳や安定性を阻害することにより、転写後レベルで遺伝子発現を調節する非コードRNAであり、腫瘍の免疫抑制や血管新生に劇的な影響を与えることができる42,43。 我々は、マウスおよびヒトのマクロファージにおいて、miRNA Let7aの発現がIl6の発現と逆相関することを見出した（補足図6a-b）。 そこで、マクロファージにおけるCD11b発現の消失がLet7aの発現に影響を与えるかどうかを検討した。 Itgam-/-およびItgam siRNA導入マクロファージと中和CD11b抗体存在下でLet7aの発現が減少した（図3d；補足図6c）。Lin28のレベルはCD11b発現や活性化によって影響を受けないため、Let7を切断して不活性化するRNA結合タンパク質であるLin28には依存しない方法だった (Supplement Figure 6b, d-e)。 ICAM-1によるCD11bライゲーションは時間依存的にLet7aの発現を促進し、一方でIl6の発現を抑制した。逆に接着を抑制すると、マウスとヒトのマクロファージの両方でLet7aの発現が抑制され、Il6の発現が促進された（図3e, f）。 重要なことは、Itgam-/-マクロファージではLet7a miRNAの異所性発現（pre-miRNA）が免疫抑制性遺伝子発現を抑制し、炎症性遺伝子発現を促進したのに対し、WTマクロファージでは抗miRNAのLet7aが免疫抑制性遺伝子発現を促進し、免疫賦活性遺伝子発現を抑制したことである (Fig. 3g). CD11bのアブレーション（図1a）と同様に、抗miRNA Let7aはPdgfbの発現を促進したが、Vegfaの発現には影響を与えなかった（図3h）。 これらの結果から、CD11bの活性化はmiRNA Let7aの発現を促進し、その結果、IL6を介した免疫抑制性マクロファージの遺伝子発現を抑制することが示された
c-Myc, 免疫抑制性マクロファージの極性を制御する転写因子はLet7 promoterに結合してその転写を抑制する；興味深いことにLet7もc-Myc発現を抑制できる44, 45. Itgam-/-マクロファージではWTマクロファージと比較してc-Myc遺伝子の発現が上昇していた（図3i）。c-Mycタンパク質の発現と、転写因子を安定化するセリン62リン酸化46もWTマクロファージと比較して上昇した（図3j）。 次に、cMycの機能を阻害することで、Let7の発現を促進し、それによってマクロファージの極性を変化させることができるかどうかを検討した。 重要なことは、Itgam-/-マクロファージではLet7a, Let7d, Let7fの発現が低下していたことである。しかし、c-Mycの薬理学的阻害によりItgam-/-マクロファージのLet7発現が回復し、Itgam-/-マクロファージの示す免疫抑制遺伝子発現上昇が回復した（図3K、L）。 Let7aはマクロファージによるPdgfbの発現を抑制することから、Let7aの発現が新生血管に及ぼす影響をin vitroとin vivoで検討した。 マイクロキャリアビーズに付着した内皮細胞と血管平滑筋細胞を，コントロールmiRNA，プレmiRNA Let7a，アンチmiRNA Let7aまたはPdgfb-bb siRNAを導入したWTまたはItgam-/-マクロファージを含むフィブリンゲル中で培養した。 Itgam-/-マクロファージはスプラウトの伸長を促したが、Let7a miRNAまたはPdgfb siRNAをマクロファージに導入すると阻害された（図4a、b；補足図6f）。 一方、Itgam-/-マクロファージではなくWTマクロファージに抗miRNA Let7aを発現させると、スプラウトの伸長が促進された（図4a, b; 補足図6f)。 さらに、抗miR Let7aを導入したマクロファージは、in vivoでbFGF飽和Matrigel中の成熟した周皮細胞被覆血管の形成を促進した（図4c）。 これらの研究を合わせると、CD11bはLet7aの制御とそれに続くPDGF-BBの発現を通じて新生血管形成を制御することがわかる。
Macrophage microRNA let-7a is required for tumor growth suppression.Fig. a, b マイクロキャリアビーズに付着した内皮細胞と血管平滑筋細胞を、コントロールmiRNA、プレmiRNA Let7a、アンチmiRNA Let7aまたはPdgf-bb siRNAでトランスフェクトしたWTまたはItgam-/-BMMを含むフィブリンゲルで培養した。 a 画像 b CD31+陽性血管長（mm）のヒストグラム（n = 10） c コントロールmiR（黒棒）または抗miR Let7a（青棒）を導入したBMMを含むin vivo培養bFGF飽和マトリゲルプラグからの切片のCD31（緑）およびSMA（赤）免疫染色；マトリゲルプラグ当たりのSMA+血管の割合の定量化（n = 25）。 d LLC腫瘍を持つ動物における抗miR Let7aの標的化送達の概略図とグラフ；コントロールの抗miRNA（黒線）または抗miRNA Let-7a（シアン線）処理動物の腫瘍体積（n = 10）。 e d (n = 3) のコントロール (黒いバー) と抗miRNA Let7a (シアンのバー) を投与した動物の末梢血細胞および腫瘍から選別した細胞集団におけるLet7a発現。 f d (n = 3) の選別したマクロファージにおける炎症因子の相対的mRNA発現。 h CD31/Desminの共局在化率（n = 30）およびFITC-デキストランの組織への漏れ（n = 25）の定量化。 i CD4+およびCD8+細胞／コントロール抗miR（黒棒）または抗miR let-7a（青棒）導入動物からの腫瘍におけるフィールド（n = 25）スケールバー、40μm j 抗miR-let7aの標的送達と組み合わせた化学療法処置の模式的表現。 k コントロール抗miR（黒）、抗miR let-7a（青）、コントロール抗miR／ゲムシタビン（緑）、および抗miR let7a／ゲムシタビン（赤）で形質転換した動物（n＝10）におけるLLC腫瘍の体積およびエンドポイント重さ。 顕微鏡写真上のバーは50μmを示す。 エラーバーはsemを示す。 「nは生物学的複製を示す。 *p < 0.05は、c-iについてはスチューデントのt検定、jについてはTukeyのポストホック検定を用いたAnovaによる統計的有意性を示す 出典データは、Source Dataファイル
Myeloid cell Let7a regulates tumor progression
To test the role of Let7aは腫瘍免疫抑制と新血管の調節における役割を担っていると考えられている。 我々は、生体内でミエロイド細胞標的ナノ粒子で抗miR Let7aを腫瘍に送達した（図）。 4d). インテグリンαβv3標的ナノ粒子は、正常および腫瘍を持つ動物の循環骨髄系細胞に特異的に取り込まれることがわかった（補足図7a-h）。 抗 miRNA Let7a を投与すると、Itgam-/-マウスで観察されたのと同程度に LLC 腫瘍の成長が促進された（Fig. 4d）。 Let7a は腫瘍内の免疫細胞および非免疫細胞で発現しているが、抗 MiR Let7a を投与すると、循環単球および腫瘍関連マクロファージでの Let7a 発現のみが抑制され、他の腫瘍関連細胞では抑制されないことがわかった (Fig. 4e)． 重要なことは、抗 MiRNA Let7a は、コントロールと比較して、腫瘍における免疫抑制および血管新生促進遺伝子の発現を刺激し、炎症性遺伝子の発現を抑制した（図 4f, 補足図 8a）ことであった。 抗miRNA Let7aはまた、トランスフェクト腫瘍において血管の正常化を促し、血管はコントロールのトランスフェクト腫瘍からの血管よりも長く、分岐が少なく、周皮細胞で強く覆われ、リークが少なかった（図4g、h）。 重要なことは、抗Let7aはまた、腫瘍へのCD8+ T細胞の動員を抑制し、腫瘍へのCD4+ T細胞の動員を促進したことである(図4i)。 これらの結果は、CD11bがmiRNA Let7aの制御を通じて、免疫抑制と血管成熟を抑制することを示すものである。 先行研究では、腫瘍における血管の正常化の増加は、腫瘍灌流を改善し、治療への反応性を促進することが示されている23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. 抗 miRNA Let7a による血管の正常化が、腫瘍の灌流を増加させることで化学療法の効果を高めるかどうかを調べるため、LLC 腫瘍を持つマウスに抗 miRNA Let7a またはコントロール miRNA の標的送達と化学療法（ゲムシタビン）の併用を行いました（図 4j）。 抗miRNA Let7aはLLC腫瘍の成長を促進したが、抗miRNA Let7aとゲムシタビンの併用は腫瘍の成長を大幅に抑制し、Let7aの阻害は化学療法への腫瘍のアクセス性を高めるという考えと一致した（図4k）。 これらの結果に従い、Itgam-/-マウスのゲムシタビン投与はWTマウスのゲムシタビン投与よりも深く腫瘍の成長を抑制することを見出した（補足図8b）。 また、Itgam-/-はWTマウスに比べ灌流性が高い（血管漏れが少ない）ことから（補足図8c）、CD11bがmiRNA Let7aへの作用を通じて、腫瘍の免疫・血管反応の制御に重要な役割を担っていることが示唆された。
The CD11b agonist LA1 inhibits tumor growth
我々の結果は、in vivoでのCD11bの標的薬理活性化が、腫瘍関連マクロファージを再極化し、その後腫瘍免疫抑制と腫瘍成長を抑制する可能性を示唆した。 そこで、CD11bの低分子アゴニストであるロイカドヘリン1（LA1）47,48（図5a）のマクロファージ極性化と腫瘍増殖への影響を調べた。 LA1は、抗CD11b中和抗体によって阻害された方法で、ICAM-1でコーティングされた基質への骨髄系細胞の接着を刺激した（Fig.） LA1はマクロファージの免疫応答遺伝子発現を刺激し、Il1b、Tnfa、Il12、Nos2、Ifng mRNAの発現の増加によって示された（補足図9a）。 LA1はLet7aの発現を刺激し、PdgfbとIl6の発現を抑制したことから（図5c）、これらの結果は、LA1が炎症性免疫応答を刺激し、in vivoでの腫瘍成長を抑制する可能性を示唆するものであった。 LA1の腫瘍関連マクロファージへの影響をin vivoで評価するために、腫瘍関連マクロファージを単離し10、事前にLA1で処理し、LLC腫瘍細胞と共植えした。 LA1はLLCやマクロファージの生存率に直接影響を及ぼさなかったが（図5e、f）、LA1処理したマクロファージは腫瘍の成長を完全に抑制した（図5d、e）。 LA1は、in vitroではCL66-Luc乳房腫瘍細胞の増殖に影響を及ぼさなかったが（補足図9b）、LA1は、タキソールよりも効果的に、同系統の直上移植CL66-Luc乳房腫瘍の増殖を強力に抑制した（図5g）。 LA1はまた、放射線照射との相乗効果でCL66-Luc乳房腫瘍の成長を抑制し（図5h）、同所移植したヒトMDA-MB-231乳腺異種移植腫瘍の成長を抑制した（図5i）。 重要なことは、LA1はマウスLLC肺腫瘍の成長をWTマウスでは抑制したが、Itgam-/-マウスでは抑制しなかったことであり、LA1がインテグリンCD11bを介して腫瘍の成長を抑制することを示した（図5j, k）。
LA1処理により、LLCおよびCL66-Luc腫瘍において、一般的に免疫能があると考えられているMHC-II+マクロファージの存在が増加し、一般的に免疫抑制性があると考えられているCD206+マクロファージの存在が減少したことから（補足図9c-d）、我々の研究はLA1が腫瘍関連マクロファージを再分極させていることを示唆するものであった。 したがって、LA1がLLC腫瘍のCD11b+細胞におけるS100A8とMMP9の発現を抑制し、CL66-Luc腫瘍においてもArginase1、S100A8、MMP9の発現を抑制することを見出した（補足図9e-f）。 これらのタンパク質は腫瘍形成促進マクロファージのマーカーであるため、これらの研究を総合すると、LA1は腫瘍関連マクロファージを再分極させることによって腫瘍の成長を抑制している可能性が高いことが示された。 実際、LA1処理により、LLCおよびCL66-Luc腫瘍の両方においてCD8 + T細胞の存在が増加した（補足図10a-c）。 また、LA1処理は、SMA+血管の数を減少させることにより、腫瘍の新生血管を変化させることも確認された（図5l）。 腫瘍の炎症性免疫プロファイルを増強し、腫瘍の血管正常化を阻害することにより、低分子CD11bアゴニストLA1は、マクロファージの極性を著しく変え、腫瘍へのCD8+ T細胞の動員を増加させ、マウスおよびヒト癌モデルにおける腫瘍の進行を阻害した
。