CAP1 は上昇しないが S308/S310 リン酸化が上昇することが明らかになった。 膵臓がん細胞で検出された
CAP1タンパク質レベルは、一般的に使用される膵臓がん細胞株{PANC-126、CFPAC-127、AsPC-128、Mia PaCa-229}のパネルでウェスタンブロッティングで測定し、対照となる不死化だが変異していない膵臓細胞株 hTERT-HPNE30 のそれと比べて比較した。 図1Aに示すように、4つの癌細胞株はすべてCAP1を豊富に発現しており、これは我々が以前にCAP1とCAP212の両方を豊富に発現していると報告したHeLa細胞のそれと同程度であった。 非形質転換hTERT-HPNE細胞は、がん細胞株と同レベルのCAP1を発現していることがわかった。 さらに、もう一つのCAPアイソフォームであるCAP2の発現量を調べたところ、PANC-1およびMia PaCa-2細胞では、hTERT-HPNE細胞と比較してCAP2の発現量がかなり上昇していた（図1A）。
CAP1上のS308/S310リン酸化の上昇、しかしCAP1発現上昇を膵臓癌細胞では検出した。 (A）ウェスタンブロットにより、HeLa細胞と同等のCAP1の豊富な発現量が4つの癌細胞株すべてで検出され、対照の膵臓細胞（hTERT-HPNE）も同様のCAP1発現量であることが明らかになった。 CAP2ブロットの結果、PANC-1およびMia PaCa-2癌細胞は、対照のhTERT-HPNE細胞よりも顕著に高いレベルのCAP2を豊富に発現していることが示された。 (B）ウェスタンブロットにより、PANC-1およびCFPAC-1膵臓癌細胞におけるCAP1のS308/S310リン酸化が、形質転換していないhTERT-HPNE膵臓細胞のそれと比較して上昇していることが示された。 リン酸化特異的な抗体は、両方の残基のリン酸化シグナルを認識する。 上部のアラインメントされた配列は、タンデムリンカー制御部位を取り囲む配列を示す。 タンデム部位のセリン残基（マウスCAP1ではS307 & S309、ヒトCAP1ではS308 & S310）は太字と斜体（下線も）で強調表示されています。 蛍光シグナルはデンシトメトリーを用いて定量し、3つの実験からの結果をスチューデントのt検定で分析し、エラーバーがS.E.Mを表すグラフにプロットした。”*”はP < 0.05、”**”はP < 0.01を示している。 (C）GSK3阻害剤6-BIOで16時間処理すると、PANC-1膵臓癌細胞とhTERT-HPNE細胞の両方で、CAP1リン酸化が用量依存的に著しく減少した。 6-BIOはCFPAC-1細胞でも同様にCAP1のリン酸化を低下させた（図示していない）。 GAPDHはウェスタンブロッティングにおけるローディングコントロールとして機能する。
我々は以前に、GSK3がマウスCAP124のS309（ヒトCAP1のS310に相当、図1Bに配列図を示す）をリン酸化することを報告した。 膵臓癌ではGSK3が過剰に活性化することが報告されていることから25、癌細胞におけるCAP1のS308/S310リン酸化の上昇の可能性について、ウェスタンブロッティングで両方のセリン残基のリン酸シグナルを認識するリン酸特異的抗体を用いて検討した24。 興味深いことに、がん細胞では、S308/310リン酸化が対照細胞に比べて有意に上昇していた（図1B、PANC-1およびCFPAC-1細胞株についてのみ定量データで示すが、AsPC-1およびMia PaCa-2細胞でも同様の結果が得られている）。 次に、強力なGSK3阻害剤である6-BIO（6-bromoindirubin-3′-oxime）31でがん細胞を処理することによりGSK3を阻害したところ、この処理により、PANC-1とCFPAC-1の細胞でCAP1上のS308/S310リン酸化が用量依存性に減少した（図1C、PANC-1の細胞についてのみ図示）。 6-BIOで処理すると、コントロールの膵臓細胞でもCAP1のリン酸化が減少した。 また、より選択的なGSK3阻害剤であるLiCl32も、後で示すように、PANC-1およびAsPC-1細胞においてCAP1のリン酸化を低下させた。 これらの結果は、GSK3が膵臓癌細胞におけるCAP1のS308/S310でのリン酸化機構の一部でもあることを裏付けている。 また、癌細胞と対照細胞を6-BIOで処理すると、未知のメカニズムでCAP1の顕著なup-regulationが見られた。
CAP1をノックダウンすると、癌細胞のストレスファイバーの増強、運動性と浸潤の減少が見られた
次に、CAP1の膵癌細胞での役割を明らかにするために、CAP1の沈黙化を試行した。 我々が以前に開発した安定したノックダウンパラダイムは、CAP112,18,24の枯渇から派生する表現型の特異性を検証することができるレスキュー戦略と互換性がある。 独立したヌクレオチド配列を標的とし、HeLaおよび乳がん細胞でCAP1を効果的にサイレンシングする2つのshRNA構築物S2およびS3を用いて、ウェスタンブロッティングで確認したように、PANC-1とAsPC-1細胞でCAP1を効率的にノックダウンした安定クローンを作成することができた（図2A）。 PANC-1 (S2-1, S3-3) と AsPC-1 (S2-3, S2-7) からそれぞれ2つの安定したノックダウンクローンが、Neomycin selectionにより樹立された。 しかし、CFPAC-1およびMia PaCa-2癌細胞株でCAP1を不活性化する試みは、成功しなかった。 CFPAC-1細胞は抗生物質選択後にコロニーを形成することができず、一方、Mia PaCa-2細胞では、スクリーニングした約2ダースの安定コロニーのいずれもCAP1の発現が大幅に減少した（データは示されていない）。 (A）PANC-1、AsPC-1ともに2つの安定クローンでCAP1を効率的にノックダウンしていることがウェスタンブロットで確認された。 CAP1はウェスタンブロッティングで検出され、GAPDHはローディングコントロールとして使用された。 (B）PANC-1細胞でCAP1を欠失させると、アクチン応力線維が増強された。 shRNAのための空ベクター（Vec）を保有する対照細胞では、アクチン応力線維は非常に限られていた（矢印で示す）。 一方、CAP1ノックダウン細胞（S2-1およびS3-3）では、ファロイジン染色後の蛍光顕微鏡観察で、アクチン応力線維が増強されていた（矢印で示す）。 (C）創傷治癒およびトランスウェル移動アッセイ（PANC-1のみ）で検出されたように、CAP1の欠失はPANC-1およびAsPC-1の両細胞において運動性を低下させた。 トランスウェル移動アッセイでは、血清を含む培地を入れたウェルに置かれた各インサート上に、一晩血清で静置した細胞〜2×104個をロードした。 16時間後、移動した細胞をスコアリングし、3つの独立した実験からデータを収集し、Studentのt-testを用いて分析し、エラーバーはS.E.Mを表すグラフにプロットされた。 (D）CAP1の欠失は、PANC-1細胞におけるマトリゲル浸潤を減少させた。 インサート膜をマトリゲルでプレコートした以外は、Transwell migration assayと同様にアッセイおよびデータ収集と解析を行った。 「は、対照細胞のものと比較して、P < 0.05を示す。 (E）CAP1ノックダウンPANC-1細胞におけるEMTの減少。CAP1ノックダウン安定クローンにおけるE-カドヘリン発現の増加およびビメンチン発現レベルの減少により示される。 GAPDHはウェスタンブロットにおけるローディングコントロールとして機能する。
我々はまず、CAP1ノックダウンPANC-1およびAsPC-1細胞における形態的およびアクチン細胞骨格の変化について調べた。 CAP1ノックダウンHeLaや転移性乳がん細胞における細胞サイズの増加12,18,24とは異なり、CAP1の枯渇はPANC-1またはAsPC-1の細胞サイズの顕著な増加を引き起こさなかった。 次に、PANC-1細胞のアクチン細胞骨格をファロイジンで染色し、その後、蛍光顕微鏡で観察した。 PANC-1細胞（および一般に膵臓癌細胞）は、HeLaやNIH3T3線維芽細胞などのアクチン細胞骨格研究によく用いられる細胞株と比較して、特にストレスファイバー（図2B）の点で組織化が不十分なアクチン細胞骨格構造であると思われる12,24。 しかしながら、CAP1ノックダウンPANC-1細胞では、コントロール細胞と比較して、ストレスファイバーが増強されていることが明らかになった（図2B）。 空ベクターを搭載した26個のコントロール細胞は、ストレスファイバーの存在が非常に限られていた。 一方、CAP1ノックダウン細胞では、27個中20個（74.1%）のS2-1、23個中18個（78.3%）のS3-3で、図2Bに示したのと同様にストレスファイバーが顕著に増加した。 ストレスファイバーの蓄積は、CAP1が枯渇した他の細胞でも一貫して観察されている12,13。この表現型は、アクチン単量体を隔離する機能とアクチンフィラメントのターンオーバーを促進する機能の両方をCAP1が失っていることに由来すると考えられている
ストレスファイバーの増強と同様に、CAP1枯渇は癌細胞を含む多くの哺乳類の細胞型で運動性を低下させていると報告されている13, 14, 17, 18, 19. 膵臓癌細胞における CAP1 の一過性ノックダウンも、創傷治癒アッセイにおいて細胞の運動性を低下させることがわかった14。 我々は、創傷治癒アッセイ、トランスウェル遊走アッセイ、マトリゲル浸潤アッセイを行い、膵臓癌細胞の浸潤性に対するCAP1安定化ノックダウンの影響を検証した。 CAP1ノックダウンにより、PANC-1およびAsPC-1細胞の創傷治癒アッセイにおける細胞運動性が大幅に低下した（図2C）。この結果は、以前に報告された結果14と一致するものであった。 CAP1ノックダウンPANC-1細胞（S3-3とS2-1の両方）の傷は、導入後24時間でわずかに回復したが、対照細胞では隙間がほぼ完全に埋まっていた。 同様の効果は、安定なCAP1ノックダウンAsPC-1クローンS2-3およびS2-7でも観察された（図2C）。 PANC-1細胞のTranswell移動アッセイの結果は、下段の定量結果のグラフに示すように、創傷治癒アッセイの結果と一致した（図2C）。 さらに、浸潤アッセイでは、CAP1の枯渇により、PANC-1癌細胞がマトリゲルを貫通して浸潤する能力も低下することが明らかとなった（図2D）。 3つの独立したアッセイから収集したデータのStudent’s t-test解析により、CAP1ノックダウンPANC-1安定細胞では浸潤が有意に減少したことが明らかになった（Fig. 2D）。 最後に、EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition) が癌細胞の浸潤に関連していることから、EMTに対するCAP1ノックダウンの効果の可能性を検証した。 実際、CAP1ノックダウンPANC-1細胞は、E-カドヘリンの発現が上昇しており、EMTの減少を示唆していた（Fig. 2E）。 また、別のEMTマーカーであるビメンチンについても検証したところ、CAP1をノックダウンするとその発現が減少することがわかった（図2E）。
CAP1のリン酸化を抑制するGSK3の阻害は、がん細胞の運動性と浸潤を減少させた
我々の以前の発見は、アクチン細胞骨格を制御するCAP1の機能には一過性のリン酸化が重要であることを示唆した24。 膵臓癌細胞においてCAP1のリン酸化が上昇し、GSK3の活性化と一致することから、リン酸化調節が癌細胞の浸潤におけるCAP1機能にも関与している可能性が示唆された。 我々は、GSK3を阻害することでS308/S310のリン酸化を抑制し、一方で調節部位での一過性のリン酸化によりCAP1の調節を阻害して、この可能性を検証した。 PANC-1細胞を6-BIOで処理した後、細胞遊走および浸潤アッセイを行った。 5 μM 6-BIOでの処理によるCAP1上のS308/S310リン酸化の減少の効果（図1C）を最初にテストした。 図3Aに示すように、6-BIO処理は、創傷治癒およびトランスウェル移動アッセイの両方において、PANC-1細胞の運動性を有意に減少させた。 また、PANC-1およびAsPC-1細胞を別のGSK3阻害剤であるLiClで処理すると、CAP1リン酸化が低下し、創傷治癒アッセイにおける細胞運動も低下することが確認された（Fig. 3A,B）。 さらに、6-BIO処理により、PANC-1細胞のマトリゲル浸潤も減少した（Fig. 3C）。 最後に、GSK3 は多数の基質分子を通して幅広い細胞機能を制御することが知られているため、細胞運動に対する GSK3 阻害の効果は、細胞骨格、細胞極性および移動の制御に関与する複数の GSK3 標的を介した集合的な出力であると考えられる34,35。 そこで、 CAP1 をノックダウンした PANC-1 細胞とコントロール細胞において、 6-BIO の細胞運動抑制効果を検証・比較した。 図3Dのグラフに示すように、6-BIO処理は、創傷治癒アッセイにおいて、コントロール（Vec）細胞の運動性を著しく低下させたが、CAP1ノックダウン（S2-1とS3-3）細胞の運動性を低下させることはなかった。 これらの結果は、S308/S310を介したリン酸化制御が、CAP1が膵臓癌細胞の運動性と浸潤を促進するために重要な役割を果たすことを支持する。
CAP1リン酸化を減少するGSK3阻害も癌細胞の運動性と浸潤を損なった。 (A）PANC-1細胞を6-BIOまたはLiClで処理すると、創傷治癒およびトランスウェル移動アッセイにおける細胞運動が低下した。 100 mM LiClで処理すると、PANC-1細胞のCAP1リン酸化も効果的に減少した。 PANC-1細胞を用いたトランスウェル移動アッセイは、図2に記載したのと同様に実施した（NTは6-BIO処理なしの細胞を示す）。 (B）100mMのLiClで処理すると、AsPC-1細胞におけるCAP1リン酸化も、創傷治癒アッセイにおける細胞運動と同様に顕著に減少した。 (C）PANC-1細胞を5μMの6-BIOで処理すると、マトリゲル浸潤アッセイにおける癌細胞の浸潤が顕著に減少した。 データ収集および分析を含むマトリゲル浸潤アッセイは、図2Dに記載したように同様に実施した。 (D）PANC-1細胞におけるCAP1のノックダウンにより、創傷治癒アッセイにおける細胞の運動性を低下させる6-BIOの効果が損なわれた。 コントロールおよびCAP1ノックダウン安定PANC-1クローンは、創傷導入後16時間培養され、破線は最初のギャップの端を示す。 細胞運動性を定量化し、Studentのt-testを用いて解析し、エラーバーが標準偏差を示すグラフにプロットした。 「はP < 0.05を，**はP < 0.01を示す．
CAP1のリン変異体は、CAP1ノックダウンPANC-1細胞において、ストレスファイバーの増強の緩和とラメリポディアの発達を促進する機能が低下していた
CAP1ノックダウン細胞からの知見は、がん細胞の運動性と侵入にCAP1が必要であるということを支持するものである。 また、GSK3阻害の結果から、S308/S310リン酸化がCAP1の機能に重要な役割を担っていることが示唆された。 次に、これらの事例をさらに立証するために、再発現戦略を採用した。 野生型CAP1 (WTCAP1) と、CAP1のリン酸化型 (S307D/S309D; DD) またはリン酸化されない型 (S307A/S309A; AA) を模倣したリン酸変異体は、以前に記述したように12,18,24、アクチン細胞骨格と細胞の形態的表現型を回復する能力を調べるためにCAP1ノックダウンPANC-1細胞で安定して再発現させた。 これらの変異体は、ノックダウン細胞内に安定的に存在するshRNAによる由来mRNAの認識を避けるために、S3 shRNA標的配列にミスマッチを有しているが、CAP112上のアミノ酸には一切変更がない。 6xHisタグに対するウェスタンブロッティングで確認したように、WTマウスCAP1、またはAAおよびDD蛍光体変異体を再発現する安定なクローンを確立することができた（図4A）。 なお、元のウェスタンブロット画像から無関係な2つのレーンが削除されていた（これらの2つのレーンのサンプルは、N末端の2つのセリン36蛍光体変異体の再発現を確認するために使用された）。 オリジナルのウェスタンブロットの結果一式を補足図1に示す。 AA変異体（AA-R）またはDD変異体（DD-R）のいずれかを再発現した細胞の形態を位相顕微鏡で調べ、WTCAP1（WT-R）を再発現した細胞における形態と比較した。 HeLa細胞や転移性乳癌細胞など、いくつかの哺乳類細胞においてCAP1をノックダウンすると、細胞サイズが著しく増大することが報告されており12,13,18、この表現型はCAPのノックダウンに特有のものであることが以前に確認されている12,18。 しかし、PANC-1細胞やAsPC-1細胞におけるCAP1ノックダウンでは、そのような効果は見られなかった。 むしろ、WTCAP1またはリン酸塩変異体をノックダウン細胞に安定的に再投与すると、実際に細胞サイズが著しく増大した（図4B）。 さらに、WTCAP1を再投与すると、強固なサイズのラメラリポディア（矢印で示す）が発達した（図4C）。この細胞内構造は、糸状アクチンに富み、細胞の方向転換を促すのに重要であるのに対し、空のコントロールベクターを保有するノックダウン細胞では、このようなラメラリポディアは実質的に全く発達しなかった。 AA変異体やDD変異体を再表現した細胞でもラメラリポディアの形成がある程度促されたが、そのサイズはWTCAP1を再表現した細胞と比較して明らかに小さかった（図4Cに矢印で示す）。 各細胞型について200個の細胞を数え、大きなサイズのラメリポディアを持つ細胞の割合は以下の通りであった。 ノックダウン細胞（Vec）では0％（0/200）、WT-R細胞では14.5％（29/200）、AA-RとDD-R細胞ではそれぞれ9％（18/200）と7.5％（15/200）であった。
アクチン細胞骨格、細胞サイズおよびラメラポディア発生に対するWTCAP1および蛍光体突然変異体のCAP1-knockdown PANC-1セルでの再発現の効果。 (A）6xHisタグに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングで、S3-3 CAP1ノックダウンPANC-1安定細胞におけるWTCAP1、AAおよびDD phosphor変異体の再発現を確認した。 無関係な2つのレーンは、元のウェスタンブロット画像から削除された（補足図1に示す）；（B）CAP1ノックダウン細胞においてWTCAP1または蛍光体変異体を再発現する細胞における有意な細胞サイズの増加を示す数値化データ。 Image-Jプログラムを用いて、1フィールドあたり50個の細胞の大きさを測定した。 データはStudentのt-testを用いて解析し、エラーバーが標準偏差を示すグラフにプロットした。 「は、空ベクター（Vec-R）を保有する対照細胞と比較して、P < 0.05を示す。 (C）位相画像は、WTCAP1または蛍光体変異体の再発現がラメリポディアの形成を促進することを示す。 WTCAP1を再投与した細胞（WT-R）の中には、極めて大きなサイズのラメラリポディアを形成したものがあった（矢印で示す）。 AA変異体（AA-R）やDD変異体（DD-R）の再表現でもラメラポディアの形成をシミュレーションしたが、そのサイズはWTCAP1を再表現した細胞のそれと比較して明らかに小さかった。 空ベクター（Vec-R）を保有するコントロールのCAP1-ノックダウン細胞では、このようなラメラポディアは観察されなかった。 (D）CAP1ノックダウンPANC-1細胞でWTCAP1を再発現するとストレスファイバーが減少するが、変異体を再発現した細胞ではストレスファイバーが増強された。 蛍光体模倣型DD変異体を再表現した細胞は、最もストレスファイバーが増強されていた。 矢印はストレス線維を示し、WT-R細胞の場合はそれがない。
次に、CAP1ノックダウンPANC-1細胞におけるストレス線維の増強を緩和するリン酸変異体の能力を見た。 図4Dの共焦点画像に示すように、WTCAP1（WT-R）の再発現は亢進したストレス線維を効果的に緩和し、それによって表現型を回復させ、ストレス線維は矢印で示す広い領域で解消された。 一方、リン酸変異体では、亢進したストレス線維を緩和する効果は低かった。 AA変異体を再発現した細胞は、WTCAP1によって救済された細胞よりもストレス線維が適度に増強されていたが、DD変異体を再発現した細胞は、さらにストレス線維が増強されていたようである。 これらの結果は、リン酸化されたCAP124に対して脱リン酸化されたCAP1が「活性型」であり、CAP1の最適な細胞機能には一時的なリン酸化が必要であると考えられるという、我々が以前にHeLa細胞で得た知見と一致している。 また、これらの結果は、CAP1が膵臓癌細胞においてアクチン細胞骨格を制御するためには、一過性のS308/S310リン酸化が重要であり、一過性のリン酸化による制御が阻害されると、アクチンフィラメントのターンオーバーを促進するCAP1機能の欠損につながることを示唆するものであった。
CAP1 phosphor mutants had defects rescuing the reduced invasiveness in the CAP1-knockdown cancer cells
動的なアクチンフィラメントのターンオーバーは細胞運動の主要な駆動力であるので、次に、リン酸変異体がCAP1-knockdown PANC-1 cellsにおける細胞運動性と浸潤性の低下をどれだけ救うかをテストしてみた。 まずTranswell migration assayを行ったところ、グラフの定量結果に示すように、WTCAP1を再表現すると、空ベクターを保有する対照細胞に比べ、細胞運動性が有意に増加した（Fig. 5A）。 再表現されたAA変異体（AA-R）は、WTCAP1ほどの効果はないものの、トランスウェル移動アッセイにおける細胞運動性の低下を部分的に回復させた。 一方、DD変異体（DD-R）は、低下した細胞運動性を救済することができず、その割合は空ベクターを保有するCAP1ノックダウン細胞と同程度であった。 これらの結果は、WTCAP1およびphosphor変異体によるストレスファイバーの増強のレスキュー能力と一致する。 さらに、図5Bに定量化した結果を示すように、CAP1ノックダウン細胞におけるマトリゲル浸潤の減少のレスキューをテストした。 同様に、WTCAP1はCAP1ノックダウンPANC-1細胞における浸潤の減少を最も効果的に救助した。AA変異体は部分的に救助したが、DD変異体は文字通り表現型を救助することができなかった。 最後に、CAP1ノックダウン細胞でWTCAP1を再発現させると、E-カドヘリンの発現も減少した（図5C）。このことから、CAP1がPANC-1がん細胞のEMTに必要であることがさらに確認された。 これらの結果から、CAP1が膵臓癌細胞の運動性と浸潤を促進するためには、S308/S310タンデム部位を介したリン酸化制御が重要な役割を担っていることが支持される。
CAP1ノックダウンPANC-1細胞の運動性と浸潤性の低下を救うWTCAP1およびリンカー変異体の効果。 (A)トランスウェル遊走試験において、WTCAP1とAA変異体はCAP1ノックダウンPANC-1細胞の運動性低下を効果的に回復させたが、DD変異体は回復させることができなかった。 実験、データ収集および解析は、Fig. 2に記載したものと同様に行った。 エラーバーはS.E.M.を表し、「*」は空ベクター（Vec-R）を保有する対照細胞と比較して、P < 0.05を示す。 (B）WTCAP1とAA変異体は、CAP1ノックダウンPANC-1細胞のマトリゲル浸潤の減少を有効に回復させたが、DD変異体も回復させることができなかった。 実験、データ収集および解析は、Fig. 2に記載したものと同様に行った。 エラーバーはS.E.M.を表し、「*」は対照細胞との比較でP < 0.05を示す。 (C）WTCAP1の再発現は、CAP1ノックダウンPANC-1細胞において上昇したE-Cadherinを回復させることも示した。
CAP1が細胞外の成長因子シグナルを仲介して癌細胞の浸潤性を制御することを裏付ける証拠
成長因子PDGFやHGF（Hepatocyte Growth Factor）36などの生理刺激はアクチン細胞骨格の再配列と細胞移動が刺激されることが知られている． アクチン細胞骨格を制御する CAP1 の機能には、S308/S310 でのリン酸化制御が重要であることから、これらの刺激が CAP1 のリン酸化を制御し、それによってアクチン細胞骨格の再配列とがん細胞の浸潤を制御している可能性を検討した。 興味深いことに、血清なしで培養したPANC-1およびAsPC-1細胞をPDGFで処理すると、CAP1のS308/S310リン酸化が、5分の時点で最も顕著に減少した（図6A,B）。 膵臓癌細胞をHGFまたは血清で処理しても、CAP1の脱リン酸化を誘導する効果はあまりなかった（補足図2；PANC-1細胞について示す）。 したがって、PDGFがアクチン細胞骨格の再編成とがん細胞の浸潤を刺激するのは、少なくとも部分的にはCAP1を介したシグナル伝達が関係していると思われる。 これらの結果は、コフィリンとの結合、リン酸化変異体の細胞内局在、懸濁培養細胞でのCAP1のリン酸化上昇などの複数の証拠が示唆するように、脱リン酸化CAP1が「活性」型であるという考えとも一致する24。 しかし、タンデム制御部位での一過性のリン酸化、すなわちリン酸化型と脱リン酸化型の間の循環は、CAP124の最適な細胞機能には必要であると考えられている。 CAP1脱リン酸化シグナルは、CAP1リン酸化シグナルと協調して機能し、S308/S310での一過性のリン酸化を駆動することによりCAP1の細胞機能を制御していると考えられる。
PDGFによるCAP1脱リン酸化を膵癌細胞で誘導した例． (A）血清飢餓状態のAsPC-1癌細胞をPDGFで処理すると、S308／S310でのCAP1脱リン酸化が誘導される。 細胞は一晩培養し、24時間血清除去した後、30 ng/ml PDGFで表示時間処理した。 細胞溶解液を調製し、CAP1上のタンデム制御部位の両残基のリン酸化シグナルを検出するリン酸化特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングに使用した。 脱リン酸化効果は、PDGF処理の5分時点で最も顕著であった。 (B） 血清飢餓PANC-1細胞をPDGFで処理すると、AsPC-1細胞と同様に、顕著なCAP1脱リン酸化も誘導された。 細胞の処理およびウェスタンブロッティングは、AsPC-1細胞で用いたのと同じ手順で行った。 GAPDHはWestern blotのローディングコントロールとして使用した。
Depletion of CAP1 in pancreatic cancer cells reduced FAK activity but did not cause changes in ERK or cell proliferation
We recently identified a new role for CAP1 in regulating the proliferation of breast cancer cells, where depletion of CAP1 exert the cell context dependent effect on proliferation, accompanied consistent changes in ERK activity18.This case is a newly extraordinary role for the CAP1は乳がん細胞の増殖を制御している。 我々は、CAP1が膵臓癌細胞においてもERKと増殖を制御しているかどうかを検証した。 CAP1ノックダウンPANC-1安定クローンでは、コントロール細胞と比較して、ERKの発現やリン酸化に有意な変化は認められなかった（補足図3A）。 また、S2-1、S3-3安定ノックダウン細胞の増殖を調べるMTTアッセイを行い、コントロール（Vec）細胞の増殖と比較したところ、ノックダウン細胞ではわずかに細胞増殖率の低下が検出された（補足図3B）。 しかし、その差は統計的に有意ではなく、S2-1細胞とコントロール細胞のO.D.（570 nmにおける）を比較したP値は0.219、S3-3細胞とコントロール細胞のそれを比較したP値は0.223であった。 これらの結果から、CAP1は膵臓癌細胞の増殖を制御する上で重要な役割を担っていないことが示された。 さらに、安定ノックダウンパラダイムはクローンのばらつきが生じやすいという全体的な傾向を踏まえ、選択バイアスによる潜在的な影響を回避し、ERKに対するCAP1枯渇の影響をより正確に反映すると考えられるCAP1安定ノックダウンPANC-1細胞のプールを作製した。 図7Aに示すように、ウェスタンブロッティングで確認したように、S2およびS3 shRNA構築物の両方に由来する効率的なCAP1ノックダウンPANC-1安定細胞のプールは、ネオマイシン選択後に確立された。 安定ノックダウンクローンを用いた知見と一致して、コントロールプール細胞と比較して、ノックダウンプール細胞において、ERK発現またはそのリン酸化における顕著な変化は検出されなかった＜1998＞＜1795＞＜7746＞＜7295＞図7＜2870＞＜1795＞＜895＞figure7＜2799＞＜8638＞＜1795＞＜915＞CAP1ノックダウンPANC-1プール細胞はFAK活性および細胞接着が減少したが、ERKには変化がなかった。 (A）S2およびS3両方のshRNA構築物に由来するCAP1-ノックダウンPANC-1プール細胞は、ウェスタンブロッティングで検出されるように、空ベクターを保有する対照プール細胞と比較して、ERKの発現または活性に変化を示さなかった。 ERK活性は、Thr202/Tyr204部位に対する蛍光体特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出された。 GAPDHはローディングコントロールとして使用した。 (B）CAP1ノックダウンPANC-1プール細胞では、コントロールのプール細胞と比較して、FAK活性の低下が検出された。 FAK活性は、ウェスタンブロッティングでその部位に対するリン酸化特異的抗体を用いて、Tyr397でのリン酸化によって評価された；（C）CAP1ノックダウン・プール細胞は、フィブロネクチンでコートしたプレート上に細胞をプレーティングしてから試験した時点（45分および2時間）で細胞接着が減少した。 約2×104個の細胞を6ウェルプレートの各ウェルにプレーティングし、示された時点で接着しなかった細胞を洗い落とした。 付着した細胞の数は、位相差顕微鏡下で無作為に5フィールドでカウントし、画像を撮影した。 (D) 3つの独立した細胞接着アッセイから収集したデータをスチューデントのt検定を用いて分析し、エラーバーが標準偏差を表すグラフにプロットした。 “**”は、空ベクターを保有する対照細胞と比較して、P < 0.01を示す。
乳癌細胞におけるCAP1のノックダウンは、転移性および非転移性乳癌細胞におけるFAKにおいて明確な変化を引き起こした18。 また、CAP1ノックダウンPANC-1プール癌細胞では、FAKの発現量に変化はないが、FAK活性が低下していることも検出された（図7B）。 これらの結果に基づき、我々はさらに、以前に行ったのと同様に、接着アッセイで細胞接着に対するCAP1枯渇の影響を検証した12,18。 その結果、両方のshRNAコンストラクトに由来するCAP1ノックダウンプール細胞は、コントロール細胞と比較して、細胞接着が著しく減少していることが分かった（図7C）。 細胞をフィブロネクチンでコーティングした表面にプレーティングした後、いずれの時点（45分および2時間）でも、CAP1ノックダウンプール細胞と比較して、対照細胞の方が有意に多く接着していた。 さらに、付着したコントロール細胞は、CAP1ノックダウン細胞と比較して、より多く、完全に広がっていた（ラメラポディアが発達し、細胞が明るく見えない）（Fig. 7C）。 比較のために3つのフィールドの付着細胞数をスコア化し、3つの独立した実験からのデータをグラフにプロットした（図7D）＜1998年＞。