4.3. ニコチン受容体の構造
電気器官や脊椎動物の骨格筋のニコチン受容体は、4種類の異なるサブユニット（a、b、g、d）がそれぞれ2：1：1：1の化学量論比で結合した5量体である。 成熟した神経支配下の筋末端板では、gサブユニットが近縁のサブユニットであるeに置き換わっている。 個々のサブユニットのアミノ酸配列は約40％同一で、共通の始原遺伝子から生じている。 ニコチン受容体は、他の5量体リガンド依存性イオンチャネルの原型となり、抑制性アミノ酸（g-アミノ酪酸、グリシン）受容体や、ある種のセロトニン（5-HT3）受容体も含まれるようになった。 5量体受容体の各サブユニットの分子量は40,000〜60,000ダルトンである。 アミノ末端210残基が事実上すべての細胞外ドメインを構成している。 この後、4つの膜貫通型（TM）ドメインが続き、第3ドメインと第4ドメインの間の領域が細胞質成分の大部分を形成している。 ニコチン性ACh受容体の各サブユニットは、シナプス後膜上で細胞外および細胞内に露出している。 3560>
受容体は25万ダルトンの非対称分子（14 nm×8 nm）で、非膜貫通ドメインの大部分は細胞外表面に存在する。 接合部（骨格筋の運動終末板や電気器官の腹面など）では、受容体は規則的なパッキング順で高密度（1万/mm2）に存在する。 この受容体の秩序化により、電子顕微鏡画像による分子構造の再構築が可能となった。 淡水・海水のカタツムリからニコチン受容体の細胞外ドメインのみに相同なACh結合タンパク質を同定し、構造的・薬理学的な特徴を明らかにした。
このタンパク質はホモマー5量体として集合し、期待通りの選択性でニコチン受容体リガンドと結合し、その結晶構造からニコチン受容体に期待通りの原子配列を示すことが明らかとなった。 さらに、ACh結合タンパク質と受容体の膜貫通部分を融合させることにより、受容体に期待されるチャネルのゲーティングや状態変化を示す機能性タンパク質が得られる。 この結合タンパク質は、構造的にも機能的にも受容体の代用品として機能し、ニコチン受容体のリガンド特異性を支配する決定因子を詳細に理解することができるようになった。 アゴニスト結合部位はサブユニット界面に存在するが、筋肉では5つのサブユニット界面のうち、a gとa dの2つだけがリガンドを結合するように進化してきた。 アゴニスト、可逆的競合アンタゴニスト、エラピドa毒素の結合は相互に排他的で、受容体上の重なり合った表面が関与している。 サブユニット界面を形成する両サブユニットがリガンド特異性に寄与している。 膜コンダクタンスの測定から、イオン移動の速度は十分に速く（毎秒5×107イオン）、イオンの回転キャリアーによるのではなく、開いたチャンネルを介したイオン移動が必要であることが示された。 さらに、アゴニストによるイオン透過性の変化（通常、主にNa+、二次的にCa2+の内向き移動）は、受容体構造に内在するカチオンチャネルを介して起こることが分かっています。 5つのサブユニットそれぞれについている2番目の膜貫通領域がチャネルの内周を形成しています。 アゴニスト結合部位はイオンチャネルと密接に結合しており、筋肉受容体では、2つのアゴニスト分子が同時に結合すると、急激な構造変化を起こしてチャネルを開く。 結合反応とゲーティング反応はともに正の協同性を示す。 チャネルの開口速度の詳細については、電気生理学的なパッチクランプ技術により、受容体1分子の個々の開閉イベントが区別され、ニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）が、リガンド結合部位を持つ細胞外ドメインと異なるイオン孔ドメインからなる5量体のサブユニットで構成されているリガンドゲートイオンチャネルであることが確認されている。 しかし、受容体結合研究は、カエルのRana catesbianaとRana temporariaの単離前庭上皮で行われたニコチン性コリン作動性受容体に特化したものであった。 感覚野に特異的に存在するニコチン様コリン作動性受容体の存在を示す証拠が示され、サブタイプ選択性を与える非定型ニコチン作動薬の結合が研究され、nAChRが興奮性神経伝達において重要な役割を持ち、薬剤や殺虫剤の重要な標的であると結論づけられている。 また、ラットゲノムから、筋のニコチン性アセチルコリン受容体のαサブユニットと相同性のあるタンパク質をコードする遺伝子群を同定した。 これらの遺伝子は、中枢神経系や末梢神経系において、機能的なニコチン受容体が存在することが知られている領域で転写されています。 胎児および新生児におけるニコチンの副作用を媒介するβ2含有神経性ニコチン受容体（nAChR）が果たす役割。 妊娠中のWTおよびβ2 nAChRサブユニット欠損変異マウスに、水または制御された用量のニコチンを供給する浸透圧ミニポンプを移植した。 その結果、交感神経副腎系の発達や呼吸・覚醒反射が、ニコチン曝露に対する脆弱性が高まる出生直後から比較的に低下することがわかった。 一方、イミダクロプリドなどのネオニコチノイドは、強力な殺虫活性を持つnAChRアゴニストである。 1990 年代初頭に導入されて以来、イミダクロプリドは作物保護と動物衛生の両方の用途で最も広く使用されている殺虫剤の 1 つとなっている。イミダクロプリド耐性の分子基盤は、5 つの nAChR サブユニット (Nlα1-Nlα4 および Nlβ1) が Nilaparvata lugens からクローニングされてきた。 イミダクロプリド感受性集団とイミダクロプリド耐性集団の nAChR サブユニット遺伝子を比較した結果、2 つの nAChR サブユニット、Nlα1 と Nlα3 において保存位置（Y151S）に一点変異があることが確認された。 Y151S点突然変異の頻度とイミダクロプリドに対する抵抗性のレベルとの間に強い相関があることが、対立遺伝子特異的PCRによって証明された。 Nilaparvata lugens α とラット β2 サブユニットを含むハイブリッド nAChR の発現により、変異 Y151S がイミダクロプリド結合の大幅な減少に関与していることを証明する証拠が得られた。 この研究は、ネオニコチノイド系殺虫剤に対する標的部位耐性の発生を直接的に証明するとともに、ニコチン受容体のカチオン結合部位の性質について調べ、ニコチン性アセチルコリン受容体がリガンドゲートイオンチャネルのプロトタイプであることを明らかにしたものである。 アゴニスト結合部位に寄与する芳香族アミノ酸が多数同定され、アゴニストであるアセチルコリンの4級アンモニウム基の結合にカチオン-π相互作用が関与している可能性が示唆された。 ニコチン神経受容体におけるコリン作動性分子のコンフォメーション、および強力なニコチン作動性物質であるアセチルコリン、アセチル-α-メチルコリン、ラクトイルコリン、1，1-ジメチル-4-フェニルピペラジン、ニコチンの結晶構造解析の相関を見出すことにより、ニコチン神経受容体に関連するコリン作動性物質のコンフォメーションが決定されうることがわかった。 3 種類のヒトグリオーマ細胞株から単離した mRNA にコードされる神経伝達物質受容体の発現。 2つの神経膠芽腫細胞株からのmRNAを注入した卵子は、試験した様々な神経伝達物質に対して電気的反応を示さなかった。
Modulation of nAChR by strychnine found that strychnine is a potent and selective antagonist at glycine receptors which was found to inhibit muscle (α 1β 1γ δ、α 1β 1γ、およびα 1β 1δ) and neuronal (α 2β 2およびα2β 4) nicotinic acetylcholine receptors (AcChoRs) expressed in Xenopus oocytes. ストリキニーネ単独（最大500μmol/L）ではAcChoRを発現する卵母細胞に膜電流を誘発しなかったが，アセチルコリン（AcCho）の過灌流の前，同時，または最中に適用すると，AcChoによって誘発される電流（AcCho-current）を迅速かつ可逆的に阻害することがわかった。 nAChRをコードする外来メッセンジャーRNAを翻訳すると、Xenopus卵母細胞で機能的な受容体が作られる。この研究では、Torpedoの電気器官から抽出したメッセンジャーRNAをXenopus卵母細胞に注入した。 これにより、機能的なアセチルコリン受容体が合成され、卵母細胞の膜に取り込まれた。 アセチルコリンによって活性化されると、卵母細胞膜のこの魚雷アセチルコリン受容体は、他の細胞のニコチン受容体に類似したイオン透過性を持つチャネルを開いた。
ニワトリ胚の前・後背側筋の発生筋細胞表面におけるアセチルコリン受容体（AChR）の局在と神経支配の過程を、西洋ワサビペルオキシダーゼ-α-ブンガロトキシン結合体を使って超微細構造レベルで研究した。 AChRの局在濃度は、0.1-0.の小さな領域に見られた。また、アセチルコリンやその生理作用を模倣あるいは阻害する薬剤のグアノシン3′濃度に対する影響も検討された。5′-環状一リン酸（サイクリックGMP）とアデノシン3′-5′-環状一リン酸（サイクリックAMP）の濃度を哺乳類の大脳皮質，心室および回腸のスライスで調べた． アセチルコリン、およびメタコリン、ベタネコール、ピロカルピンなどの主にムスカリン作用を有するコリン作動薬は、調査した3つの組織すべてにおいて、サイクリックGMPの濃度の増加、またはサイクリックAMPの濃度のわずかな減少を誘導した。
ヒト神経細胞のα7 AcCho受容体（α7 AcChoR）とそのL248T変異体（mut）の機能特性と細胞局在性を、単独または増強型緑色蛍光タンパク質（GFP）との融合遺伝子として発現させることにより検討した。 野生型、mutα7、またはキメラサブユニットcDNAを注入したXenopus卵母細胞は、AcChoに曝されると膜電流をゲートする受容体を発現した。 すでに知られているように、wtα7受容体によって生成されたAcCho電流は、mutα7受容体によって誘発されたものよりもはるかに速く減衰する。 運動制御におけるβ2ニコチン受容体とドーパミン経路の相互作用 アセチルコリン（ACh）は、nAChRの刺激を通じてドーパミン作動性（DAergic）ニューロンの活性を調節することが知られています。 しかし、DAを介した運動量に関与するnAChRのサブユニット組成や特異的な位置は、生体内でまだ確立されていない。 nAChRのβ2サブユニット欠損マウス（β2KO）は、オープンフィールドにおいて顕著な多動性を示し、DA神経伝達のアンバランスが示唆されている。 しかし、ニコチン受容体のドメインM2内の変異により、5-Hydroxytryptamineがアンタゴニストからアゴニストに変換されることから、野生型鶏サブユニットをコードするcDNAを注入し、Xenopus卵母細胞で発現したホモマー神経性ニコチン受容体（nAcChoR）に対する5-Hydroxytryptamine（5HT）の作用について研究された。 AcChoは大きな電流を誘発し、その電流は5HTによって可逆的かつ用量依存的に減少し、半減期濃度およびヒル係数が変化した。 細胞傷害性Tリンパ球のコリン作動性受容体の研究およびコリン作動性アゴニストは、感作リンパ球が感作アロ抗原を有する細胞を傷害する能力を有するが、攻撃リンパ球集団のコリン作動性受容体は、感作攻撃細胞が標的細胞に媒介する傷害を定量化するin vitroシステムの薬理操作で研究されている＜3560＞。