Abstract
Macrophage は、病原菌や異物を貪食する強力な能力に加えて、ホスト防御において重要な役割を担っている。 免疫制御、創傷治癒、組織恒常性維持など様々な役割を担っている。 マクロファージは、単球に由来するM1型マクロファージ（古典的活性化）と、組織に定着するM2型マクロファージ（代替活性化）に極性化することができる、高い異質性を持っていることが特徴である。 皮膚の創傷治癒過程から、これらの異なるサブタイプのマクロファージが組織の修復やリモデリングにどのように関与するかは、これまでの研究で証明されているが、腸の吻合部治癒におけるマクロファージのメカニズムはまだ確立されていない。 本総説では、吻合部治癒の生理的経過における極性マクロファージの異なる役割と、消化管手術後の最も危険な合併症である吻合部漏出における病的役割に関して、現在得られている証拠をまとめた
1. はじめに
マクロファージは、炎症と宿主防御に中心的な役割を果たす骨髄性免疫細胞である 。 この細胞は強力な貪食能力を特徴とし、いわゆる「自然免疫」と呼ばれるプロセスを通じて、宿主を感染から守っていると考えられている。 近年、マクロファージは最も汎用性の高い細胞であることが証明されている。 マクロファージの役割は、宿主防御を行う免疫エフェクター細胞としての「ゴミムシ」から、炎症反応の調節、組織の恒常性の維持、創傷治癒や組織のリモデリングに関与する「監督者」「実行者」へと移行している。 吻合は、消化管腫瘍の摘出や腸管切除の後、外科医が消化管の続きを再建するために造られる。 吻合部の異常治癒は、吻合部からの内容物の漏出を意味する吻合部漏出（anastomotic leakage, AL）に発展する可能性があります。 大腸手術後の最も危険な合併症であり、術後死亡率40％、入院期間の長期化、敗血症の治療や再手術の必要性による医療費の増大の原因となる
巨視的観点から見ると、ALの原因は主にコミュニケーション、感染、治癒障害などが挙げられる。 しかし、細胞レベルでの詳細なメカニズムは、限られたエビデンスのため、まだ確立されていない。 本総説では、マクロファージの異種集団とその相反する極性に基づき、正常な吻合部治癒におけるマクロファージの役割と吻合部漏出におけるマクロファージの病的な役割について考察する。 マクロファージの種類
マクロファージや単核食細胞は造血幹細胞（HSC）に由来すると長い間考えられてきました。 マクロファージはすべて単球に由来し、また単球から補充されるとするのが一般的なドグマであった。 しかし、マクロファージファミリー細胞（単核食細胞系の細胞）は、その形態と生物学的機能の両方において、著しい異質性を示している . これらの最近のデータは、「造血幹細胞-単球-マクロファージ」という長年の概念に疑問を投げかけている。 肝臓のクッパー細胞、皮膚の表皮ランゲルハンス細胞、脳のミクログリアなどの組織常在マクロファージは卵黄嚢に由来し、造血幹細胞とは独立して成体マウスで存続できることを示す証拠である . これらの組織常在マクロファージは、ある状況下では血液中の単球からも補充されるかもしれないが、その場で更新することができる。 マクロファージは、単球由来のマクロファージが急性炎症反応において抗菌プロセスに関与するのとは対照的に、異なる機能的特性を示し、組織の構造、機能、恒常性の維持に中心的な役割を果たすが、吻合部治癒におけるその役割についてはさらに後述する。 一般に、マクロファージの極性は、M1型マクロファージになる古典的活性化（M1）とM2型マクロファージになる代替活性化（M2）に大別される。 これら2種類のマクロファージは、微生物産物、損傷細胞、活性化リンパ球からのサイトカインなどの微小環境シグナルに応答して、多様な機能表現型を発揮する。 具体的には、Toll様受容体（TLR）のリガンドやインターフェロン-γ（IFN-γ）はマクロファージをM1型に誘導し、逆にインターロイキン-4（IL-4）やインターロイキン-13（IL-13）はマクロファージをM2型に誘導する ……。 しかし、このような説明は、すべての異なる活性化シナリオを完全に説明するものではない可能性がある。 Murrayらは、M1とM2の間に、IL-4やIL-13によって誘導されるM2a、免疫複合体（TLR）によって活性化されるM2b、グルココルチコイド、トランスフォーミング増殖因子（TGF）、インターロイキン10（IL-10）によって不活化されるM2cなどのサブタイプがあるはずであると提唱した。 さらに、TLRアゴニストやアデノシンによって活性化されるM2dというサブタイプが存在する可能性も報告されている。 このように、マクロファージの極性は、M1とM2という2種類のマクロファージが対極に位置する、連続したスペクトルとして捉えられるべきと思われる。 MosserとEdwardsが提案した別の極性分類では、マクロファージは活性化されて、それぞれ宿主防御、創傷治癒、免疫調節を担当する3つの集団を形成するとされている 。 著者らは、マクロファージを刺激ではなく、その基本的な機能に基づいて分類している。 先に述べた「M1-M2」パラダイムの概念と一致し、単球由来マクロファージの多くは古典的な活性化を受けてM1表現型を発現し、宿主防御を行う。逆に、組織内在性マクロファージは主にM2様特性を発現する代替経路で活性化し、組織の恒常性や炎症の治癒を維持することがわかった。 生理的吻合治癒における偏光マクロファージの役割
消化管壁には4層（粘膜、粘膜下層、固有筋層、漿膜）があり、吻合治癒に必要なマクロファージはこの4層で構成されている。 古典的なエンド・ツー・エンドの逆腸吻合では、漿膜の付着によって消化管の両端の隙間がなくなり、無菌の腹腔を内腔の内容物とバクテリアから保護するバリアとなる。 粘膜下層は血管、リンパ管、神経線維からなり、消化管手術後に活性化し、コラーゲンの沈着を始める線維芽細胞の供給源となる層である。 この層にあるステープルや縫合されたコラーゲン線維は吻合部の引張強度の大部分を担うため、粘膜下層は吻合部の治癒において非常に重要な役割を果たす。 粘膜層はまた、治癒のプロセスを可能にするために、恒常性を維持する役割を担っている。 消化管粘膜のマクロファージは体内で最も大きな組織マクロファージのプールであり、マクロファージの長期間の欠落や機能不全は吻合部の治癒を阻害する。 それとは異なり、消化管の治癒は解剖学的に検査が困難であり、外科医は患者の一般的な健康状態のパラメータのみで手術の成功を判断することができるのみである。 皮膚と吻合部の治癒には、解剖学的構造（例えば、皮膚組織には漿膜に相当する解剖学的構成要素がない）、コラーゲンおよびコラゲナーゼ活性などいくつかの相違点がある . しかし、傷害に対する古典的な反応は、すべての臓器や組織で起こる。 吻合部治癒の生理的経過は、炎症、新組織形成、リモデリングの3つの重複するが異なる段階に分けることができる（図1）
1.2.1. 炎症
多様な微生物因子の感染に加えて、外科手術のような傷害や外傷は、さらに初期炎症反応と後期炎症反応に分けることができる非病原性関連炎症を導くことができる 。 初期炎症段階では、まず好中球が循環血中から創傷組織（吻合部）に動員されます。 これらの好中球は、局所の異物や細菌を除去した後、アポトーシスやネクローシスを起こします。 その後、単球が採用され、貪食能の高いマクロファージに分化する。 マクロファージは、傷ついた好中球や組織の残骸を貪食して、組織の損傷を防ぐ。 この段階で、汚染された環境では病原体関連修飾パターン（PAMPs）、無菌環境では損傷関連修飾パターン（DAMPs）に応答して、マクロファージは古典的に活性化し、M1表現型を発現するようになる . M1マクロファージは、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン-1（IL-1β）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-12（IL-12）などの炎症性サイトカイン、プロテアーゼ、活性酸素種（ROS）を高濃度に放出し、これらはすべて微生物の死滅と炎症反応に重要であると考えられている . また、M1マクロファージは、コラーゲナーゼという高活性酵素を産生し、吻合後早期にコラーゲン分解を引き起こし、吻合強度を低下させることがあります。 炎症後期には、アポトーシス好中球の過剰な貪食により、マクロファージ上のβ2インテグリンがアポトーシス好中球と係合し、マクロファージが抗炎症メディエーターであるトランスフォーミング増殖因子（TGF）を発現するように活性化される 。 一方、TNF-αやIL-1βのような炎症性サイトカインの産生は抑制された。 このように、マクロファージの表現型は、炎症性M1様から抗炎症性M2様へと切り替わる。 このマクロファージはIL-10などのサイトカインを産生し、血管内皮増殖因子（VEGF）などの増殖因子を分泌して新しい組織形成の基礎を作る。 IL-10、TGF、グルココルチコイドで刺激されたマクロファージはin vitroで抗炎症性マクロファージと共通したM2cサブタイプに偏極することから、抗炎症性マクロファージはM2c型マクロファージに属し、IL-10とTGFを分泌してフィードフォワードループにより抗炎症反応を増幅できることが示唆された。 また、抗炎症性マクロファージの抗炎症能や再生能は、無菌環境、例えば手術創.2013>
1.2.2 において、完全にIL-10依存的であることが示された。 新しい組織の形成
この段階では、組織に常駐するマクロファージや末梢血から回収されたマクロファージ（profibrotic macrophage）が、TGF、血小板由来成長因子（PDGF）、線維芽細胞成長因子-2、インスリン様成長因子-1など様々な成長因子を生成している 。 その中でもTGFは、線維芽細胞に作用し、創傷組織で筋線維芽細胞への分化を活性化するプロフィブロティックサイトカインである。 筋線維芽細胞は、コラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞外マトリックス（ECM）成分の塊を作り、組織欠損部を埋める。 消化管の場合、コラーゲンは平滑筋細胞によっても産生される。 消化管のコラーゲンのサブタイプは、コラーゲンI、III、Vであり、皮膚ではコラーゲンIとIIIのみであるのに比べて。 筋線維芽細胞の効率的な収縮力によって、破断した創傷組織は結合され、その完全性を再構築することができる . 一方、プロフィブロティックマクロファージと活性化線維芽細胞は、VEGFなどの血管新生因子を放出し、内皮前駆細胞を創傷組織に向かって這い出させ、新しい血管形成を促進する（血管新生）。 毛細血管の侵入により、局所組織への血液供給が増加し、吻合部の治癒が促進される。 さらに、実験的に切除したウサギの治癒大腸粘膜の研究から、治癒腸管筋層に豊富な間葉系細胞が毛細血管侵入に伴って存在することが示された；これらの細胞は平滑筋細胞や組織球に分化し、平滑筋組織の再形成に関与していると考えられている . Profibrotic macrophage, myofibroblast, and neovesselsはすべて、創傷治癒の正常な過程における最も重要な基本的区画である肉芽組織を構成している . これらのプロフィブロティックマクロファージは、in vitroでIL-4やIL-13によって誘導されることから、機能的にはM2a様マクロファージに分類される . しかし、生体内では抗炎症性マクロファージとプロフィブロティックマクロファージを明確に区別できるかどうかは不明であり、マクロファージの可塑性が創傷治癒中に混合あるいは連続した変種シフトを作り出していると思われる .
1.2.3. Remodeling
吻合部のリモデリングは、ECMの沈着と分解、組織のリモデリングのバランスに基づいた治癒組織内の成熟の動的プロセスである 。 このダイナミックなバランスを維持するために重要なのが、線維化マクロファージと呼ばれる組織常在マクロファージの一部である。 マクロファージは、マトリックスメタロプロテアーゼ-2（MMP2）、マトリックスメタロプロテアーゼ-9（MMP9）、マトリックスメタロプロテアーゼ-12（MMP12）、マトリックスメタロプロテアーゼ-19（MMP19）などを産生し、高分子物質、すなわちECMの最も重要な構成要素の一つであるコラーゲンを分解しています。 粘膜下層は消化管の強度の高い層で、コラーゲンが主成分であり、この層のリモデリングが吻合部の強度を支配しています。 線維芽細胞から分泌されるMMPsによって、最初に沈着したコラーゲン線維は再配列、架橋され、III型コラーゲンからI型コラーゲンへとリモデリングされ、後者の方がはるかに強度が高くなる。 さらに、線維芽細胞は、MMPの活性を抑制する組織メタロプロテアーゼ阻害剤（TIMPs）を合成することによっても分解を制御している。 さらに、線維芽細胞のアポトーシスを誘導し、アポトーシス細胞を除去し、IL-10の放出によってさらなる炎症を抑制する役割を担っている 。 このように、マクロファージは吻合部の治癒に関わる全ての生理的過程に関与している。 組織修復の3つの主要な段階のうち、マクロファージは段階ごとに異なる表現型を示す。 正常な組織修復の状態では、少なくとも4種類のマクロファージが存在する。 (1）炎症性マクロファージ、（2）抗炎症性マクロファージ、（3）プロフィブロティックマクロファージ、（4）線維化マクロファージである。 この4種類のマクロファージを「M1-M2」のパラダイムで分類すると、炎症性マクロファージはM1型マクロファージ、線維化マクロファージはM2a型マクロファージに相当すると考えられる。 一方、抗炎症性マクロファージと線維化マクロファージは、おそらくM2c型マクロファージに属している。 吻合部漏出におけるマクロファージの役割
前回のレビューで述べたように、ALの発生には主に3つの要因がある：コミュニケーション、感染、治癒障害である。 コミュニケーションとは、消化管内腔と腹腔をつなぐ吻合部における消化管の欠損を意味し、感染とは、消化管内腔と腹腔をつなぐ吻合部における消化管の欠損を意味する。 感染とは、吻合部位の細菌感染を示す。 Healing disturbanceとは、低酸素や炎症など、正常な治癒過程を阻害するすべての物質を指す。 これら3つの因子は活発に相互作用し、ある因子が起こると、すべての因子からなる反応の連鎖が始まり、最終的にALに至る。 例えば、感染症は吻合部に炎症反応を引き起こし、コラーゲンの沈着を阻害し、正常な治癒過程を阻害し、消化管内壁と消化管外壁との間の連通をもたらす。 逆に、腸管内容物（細菌を含む）が腹腔内に移動し、腹腔内感染を引き起こし、吻合部の治癒を遅らせることになります。 臨床的には、感染や治癒障害は持続的な生物学的プロセスであるのに対し、communicationはある程度、マクロな臨床結果とみなされている。 吻合部感染症は、吻合部剥離（腸管内容物が無菌状態の腹腔内に漏出）や術前・術中の汚染によって引き起こされることがある。 感染原因にかかわらず、汚染された感染環境では、マクロファージは上記のようにM1型に偏極する。 しかし、細胞内細菌に対する抵抗力を支え、感染症の急性期をコントロールする代わりに、過剰または長期のM1プログラムは患者にとって有害であることが、大腸菌の急性感染症で証明されている 。 腸内常在菌である大腸菌は、TLR4によるリポ多糖（LPS）の認識を通じて、典型的なM1プロファイルを誘導することができる。 典型的なM1型マクロファージは、一酸化窒素（NO）の生成に関与する誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）の発現を上昇させる。 NOは、最初に動脈血管拡張を媒介することが確認され、その後、病原体に対する宿主防御の役割を持つことが判明した 。 さらに、コラーゲンの沈着、線維化、瘢痕形成において、NOが重要な役割を果たすことが報告されている . 感染症や炎症のように、創傷のNO濃度が高くなると、創傷のコラーゲン合成が著しく損なわれる。 コラーゲンの沈着が減少すると、吻合部の強度が著しく低下し、吻合部の治癒が阻害される可能性がある。 腹腔内細菌感染におけるマクロファージの不適切なM1偏光は，AL発症の一因となる． 正常な状態では、組織の修復は組織の残骸や死細胞の除去から始まり、マクロファージがそれらの「組織のゴミ」を効率的に貪食し、炎症のタイムリーな解決と治癒の成功に重要である。 しかし、糖尿病合併患者や高齢者、化学療法を受けた患者では、マクロファージの貪食能力が著しく低下し、吻合部にアポトーシス細胞やネクロシス細胞が蓄積されることになる。 この死細胞の蓄積は、炎症期を長引かせ、治癒過程を乱し、炎症の治癒を危うくする。 虚血や吻合部低酸素などのその他の障害は、吻合部治癒を著しく損ねる。 細胞レベルでは、マクロファージを無酸素環境に置くと、IL-1βやTNF-αなどの炎症性サイトカインやNOなどの細胞障害性メディエーターが発現し、低酸素がマクロファージのM1表現型への極性を促進することが示されている。 M1マクロファージが過剰に活性化すると、炎症反応が持続し、吻合部の適切な治癒と再構築に影響を与える修復プロセスの後続段階が阻害されるため、その関連メカニズムは前述の通りである。 M1型マクロファージは正常な創傷治癒の初期段階に関与しているが、M1からM2への極性転換が、一過性の炎症反応とその後の組織再生の基礎を築くことになる。 ある病態（感染症、虚血、糖尿病など）では、マクロファージが異常に活性化されてM1型マクロファージになったり、抑制されてM2型の表現型が発現し、吻合部での炎症反応が長く続き、コラーゲン沈着や組織修復に影響を与える。これらはすべて吻合部リークと関連していると考えられている。
2 結論
マクロファージは最も汎用性の高い免疫細胞であり、大きな可塑性と異質性を持っている。 マクロファージは主に2つの極端に分極し、対応する表現型(M1とM2)を発現することができる。 マクロファージが多様な生物学的機能を発揮するためには、その極性化が前提となるため、吻合部治癒の生理的過程やALの病態形成において、極性の異なるマクロファージが異なる役割を担っています。 ALをマクロファージという視点から捉え直すことは、新たな診断方法や治療標的の探索に貢献します。 例えば、吻合後の回復期には、マクロファージが分泌する IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, ROS, NO などのサイトカインや炎症メディエーターのスペクトルが変化している可能性があ る。 また、これらの物質の濃度は、間接的に吻合部の状況を反映する可能性がある。 これらの物質の異常な変動は、吻合部治癒の障害や脱落を意味し、ALの前兆と考えられる。 M1型マクロファージはALを刺激し、M2型マクロファージは吻合治癒に必須であることから、M1/M2偏光の制御は将来的にALの治療における役割を見出すことができる。
Authors’ Contributions
Jinyao ShiとZhouqiao Wuが第一著者である。
Acknowledgements
この論文は北京市科学技術委（番号D141100000414004とZ151100004015070）と北京市保健家庭計画委（番号2014-1-2151）によって支援されている。