Structure and Functions of Blood Vessels and Vascular Niches in Bone

Abstract

骨は、エネルギー代謝、ミネラル恒常性、骨形成、造血など骨格の重要な生理機能を調整する様々な細胞タイプのための育つミクロ環境を提供している。 内皮細胞は、複雑な血管網を形成し、骨内の様々な微小環境を組織化し維持している。 最近、骨血管系の不均一性が明らかになり、骨髄区画内に複数の血管ニッチが存在することが支持されている。 特定の微小環境を規定する細胞や因子のユニークな組み合わせは、特定の機能を媒介する制御シグナルを供給する。 本総説では、発生と恒常性維持における多能性造血幹細胞および間葉系幹細胞の挙動を制御する上で重要な役割を果たす骨内の血管ニッチに関する理解の最近の進展について述べる。 はじめに近年の血管生物学の進歩により、様々な生理的・病理的状態における血管とその特徴についての理解と知識が深まってきた。 血管は輸送導管システムとして機能するだけでなく、臓器発生、組織形態形成、炎症、バリア形成、創傷治癒において重要な役割を担っている 。 また、多くの疾患の発症に血管が積極的に関与していることから、このような生体内の多様な輸送ネットワークを理解することが基本的に必要であることが示唆されています。 血管は骨格系に不可欠な部分であり、骨の恒常性の維持に様々な役割を担っている。 骨における血管の重要性は、当初、外科医によって骨折の修復と治癒の際に認識されました。 骨形成と骨折の修復において骨血管が果たす重要な役割については、現在も精力的に研究が進められている。 さらに、全身代謝、脳機能、ミネラルホメオスタシスなどの骨の多面的機能における細胞特異的な貢献は、いまだ解明されていない。

骨中の血管は、造血幹細胞（HSC）や間葉系幹細胞（MSC）に育つ微小環境を提供すると報告されている。 このような骨内の微小環境は、発生・成長・疾病時の機能を理解する上で、未だ十分な特性評価が必要である。 近年の骨画像診断技術の進歩により、骨格血管に関する基礎知識は大幅に向上した。 本総説では，骨血管系とその微小環境に関する最近の進展と現代的な理解について概観することを目的とする。 骨格系における血管の構造と特性

2.1. 骨格の血液循環

骨には広範な血管網があり（図1）、安静時心拍出量の10～15％近くを消費している。 血管の空間的配置により、骨髄区画内の様々な場所に酸素と栄養を効率的かつ最適に供給することが可能である。 骨の種類に関係なく、骨への主な血液供給は皮質部に入る動脈から始まり、髄質洞と連結して最終的に静脈を通って骨から排出されます。 しかし、骨格の形状や種類によっては、動脈と静脈の間に存在する毛細血管網の配置に影響を与える可能性がある。 大腿骨や脛骨のような典型的な長骨には、いくつかの動脈と細動脈があり、これらは血液を供給する部位によって分類されている。 中心動脈は栄養動脈とも呼ばれ、孔から骨に入り、多数の細動脈と細動脈に分岐して成人の骨の最大部位に血液を供給しています。 この動脈は高い血圧を維持して遠方に達し、通常は骨幹部と骨内膜に存在する毛細血管に終止符を打つ。 中央には大静脈があり、様々な部位に存在する毛細血管から血液を受け取り、骨から脱酸素化血液と栄養廃棄物を排出する。 骨膜動脈は骨の外表面に供給され、ボルクマン動脈を介して皮質部に存在するハバース動脈と連結している。 ハバース動脈は皮質の長骨の縦軸に平行に走り、短いボルクマン動脈は長骨の縦軸に垂直に走る。 ハバース動脈は最終的に骨幹部毛細血管に収束して髄質に血液を送り込む。 一方、骨端動脈からの血液供給は、長骨の髄質領域に入る経路を持たないため、骨端領域では別の血液循環が維持される。 骨端動脈は、長骨の末端付近に存在する関節周囲血管叢の重厚なネットワークから骨内に入る。 骨端部の血液を排出する静脈は、髄質部に存在する静脈に比べ比較的小さい（図1）。

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

図1

長骨内の血管配置図です。 (a)長尺骨の骨端部、骨幹部、骨幹部における動脈、静脈、毛細血管の配置を示す縦断面図である。 動脈はより細い細動脈に分岐し、H型毛細血管で終末を迎える。 H型毛細血管は骨幹と骨内膜領域の骨形成細胞の近くに局在している。 L型毛細血管は、中心静脈で終末を迎える洞状の血管である。 (b) 横から見た長骨の皮質と髄質領域における骨血管のパターン。 髄質部には大きな中心静脈と少数の栄養動脈が顕著である。 (c)皮質と髄質の血流のつながりを示す血管の配置。 骨膜血管は皮質血管と断続的につながっている。

2.2. 血管の不均一性

動脈血供給における分岐は、骨に複数の静脈と毛細血管のサブタイプが存在することを想定している。 しかし、これらの血管内の多様性は最近までよく理解されていなかった。 骨格血管の大部分を占めるのは、柵状毛細血管と類洞状毛細血管である。 これらは骨の骨髄腔に存在する高度に分岐した血管網である。 洞様内皮細胞は血管内皮増殖因子受容体3（VEGFR3）を発現しているが、骨動脈内皮はVegfr3に対して陰性である。 骨の血管構造は、laminin+/lowSca-1-/low sinusoids、Sca-1+laminin+ endosteal vessels、Sca-1+laminin+ central arteries として区別できる。 生後発達中の血管を調べた結果、骨の活発な成長領域に存在するH型と呼ばれる新しい血管のサブタイプが同定された。 この血管は、エンドムシン（Emcn）とCD31（Pecam1）という血管マーカーを高レベルで発現しており、これらのマーカーを低レベルで発現する洞様血管と比較して、タイプLと呼ばれている。 H型毛細血管は、L型毛細血管が枝分かれしたネットワークであるのに比べ、直線的な構造の柱状に配列された血管である。 骨の血管新生を担うタイプHの血管の最前線には、バルジ型の内腔構造が存在する。 しかし、このような血管前面のユニークな構造の機能的な意義はまだ不明である。 動脈および細動脈はエフリンB2 (Efnb2) を発現し、Emcnの発現は陰性である。 H型内皮のうち、Efnb2とEmcnの両方を発現する内皮細胞の亜集団が、細動脈血管を生成すると提唱されている（Efnb2+, Emcn-）。 このH型血管の一部には、Sox17やneuropilin-1といった他の動脈血管マーカーが発現している。 動脈はα-平滑筋アクチン＋（αSMA＋）間葉系細胞でしっかりと包まれており、より小さな細動脈はαSMA-と血小板由来成長因子受容体β＋（PDGFRβ＋）血管周囲細胞で構成されている。 複数のタイプの骨間充織細胞およびそれらの血管サブタイプとの関連については、この総説で後述する。 このように、骨血管系は異質で独特であり、組織特異的な血管修飾や特殊な機能を理解するために深い研究が必要である。 骨における血流と酸素供給 血管は組織全体に適切な酸素と栄養を供給するために、どの組織でも複雑に配置されており、独特である。 長骨では血管のサブタイプがはっきりとしており、特異な血流パターンを示している。 H型血管はL型血管に比べ、血流速度が速い。 H型毛細血管から血液が流下すると、骨幹部で血管が分岐するごとに血流速度が低下し、骨幹部ではL型毛細血管に特徴的な低血流となる。 骨幹部では血管網が頻繁に分岐・合流するため、骨幹部毛細血管の血流速度が低く保たれる。 骨血管微小環境における酸素状態

骨における特異な血流パターンは、骨微小環境の酸素状態と一致する。 生きたマウスで局所酸素張力（pO2）を測定したところ、骨内膜領域では深部の洞底領域よりもpO2が高いことが示された。 骨内膜領域はH型毛細血管と細動脈によって血管が形成されているのに対し、洞底領域はL型血管によって血管が形成されている。 また、動脈血管やH型血管の血管透過性は低く、柵状で透過性の高い洞道と比較して、微小環境における活性酸素種（ROS）を低く維持することが示されている . ヘキスト灌流したマウスの造血幹細胞を分析したところ、長期造血幹細胞（LT-HSC）の局在は、BMの最も灌流の少ない領域に限定されることが示された。 低酸素の微小環境は造血幹細胞の維持に役立ち、酸素ストレスによる損傷から造血幹細胞を保護する。 低酸素依存的な低酸素誘導因子（HIF）の安定化は、血管、間葉系細胞、造血系細胞でそれぞれ異なる役割を果たす標準的なHIF媒介シグナル経路に不可欠である

HIF-1α を介した軟骨細胞の成長と生存の制御は、軟骨形成と成長板の発達に不可欠である。 HIF-1αの下流の重要な標的はVEGFであり、生理的および病的状態における血管形成に必要な基本的な因子である 。 VEGFは、骨の発生、成長、修復の過程でいくつかのプロセスを制御する多面的な役割を担っています。 軟骨細胞における遺伝子研究では、軟骨形成の制御に加え、血管新生と骨形成におけるVEGFの重要な機能が明らかにされました。 したがって、低酸素を介したHIFの制御は、VEGFのレベルを制御し、骨における血管の成長と骨形成をカップリングする。 骨形成細胞におけるHIFの安定化は、造血幹細胞ニッチの拡大と骨におけるエリスロポエチン産生の促進をもたらす。 造血幹細胞はまた、HIFシグナルを利用して、骨髄での細胞周期と静止状態を正確に制御している。

ゼブラフィッシュの発達中の血流を遺伝的および薬理学的に操作すると、原始造血幹細胞での一酸化窒素合成酵素シグナルに影響を与え、造血幹細胞の発達に欠陥が生じた。 血流は骨から様々な臓器や組織へ造血細胞を動員する上でも重要な役割を担っている。 マウスでは、高い透過性を持つ洞様血管が造血幹細胞の移動と分化を促進する。 骨では加齢に伴いH型血管や細動脈が減少し、骨格の血液灌流や造血幹細胞の機能が低下している。 また、骨内の血流を操作すると、血管新生や骨形成が阻害されることから、血流が加齢性骨量減少の潜在的な原因であることが示唆されている。 これらの証拠は、骨形成と造血を制御することにより、骨格の恒常性を維持する上で血流が重要であることを主張しています。 骨格における血流の臨床的重要性

骨構造の違いにもかかわらず、齧歯類モデルからの研究は、ヒトの骨疾患を対象とした治療戦略の開発に有益であった。 骨格系における血管や血流の基本的な理解は、主に齧歯類モデルでの知見から得られている。 げっ歯類はヒトと同様に加齢に伴う骨量減少を示す。 驚くべきことに、マウスの加齢に伴う骨動脈毛細血管の減少は、ヒトの加齢に伴う大腿動脈血流の減少と一致する。 加齢や骨粗鬆症のヒトでH型血管が減少していることが最近明らかになり、ネズミで骨格血管を調べることの重要性が浮き彫りになっている。 骨粗鬆症の高齢女性の骨で血液供給の減少が測定された。 骨への血液供給の障害は、骨細胞の死滅を引き起こし、骨壊死の発症につながる。 片側動脈閉塞性疾患患者における比較研究では、血流の欠陥が骨塩基形成に悪影響を及ぼすことが示された。 軟骨下領域の血流不全は、変形性関節症発症の潜在的なメカニズムとして同定されている。 糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、高血圧など、血管灌流を損なう全身疾患は、骨欠損と関連している。 さらに、骨折治癒や修復の際にカルス形成を開始するためには、血液供給が重要である。 骨折部位では血管形成不全が観察され、治癒・再生過程の遅延を示す。 ベッドレストや後肢免荷などの障害による骨減少状態もまた、骨への血液供給の変化と関連している。 このような実験結果を裏付ける臨床データがあるにもかかわらず、これらの臨床症状の発生に関わる分子メカニズムの解明にはさらなる研究が必要である。 間葉系細胞の血管微小環境

4.1. 骨髄間質を形成する間葉系幹細胞および前駆細胞の種類

骨髄間質細胞集団の大部分を占める間葉系細胞は、骨髄微小環境の重要な構成要素を形成している。 Multipotent mesenchymal stem and progenitor cells（MSPC）は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、網状細胞など様々なタイプの骨髄間葉系間質細胞を生成することができる。 骨髄間質細胞の階層的関係の解明は、現在でも精力的に行われている研究分野である。 異なる臓器におけるMSPCの血管周囲への起源が示唆されているが、発生途上の骨髄では、ストローマ細胞の異なる波が同定されている。 遺伝子系統の追跡技術は、骨髄間葉系細胞の異質性を理解する上で重要な知見を与えている。 Nestin-GFP+細胞は、動脈とH型毛細血管を形成する内皮細胞（EC）を包んでいる。 血管周囲のNestin-GFP+細胞は、骨髄間質および骨系細胞を生成することができる初期MSPCをマークすることが確認された 。 同様に、osterix+新生児間葉系細胞は、骨系細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、BMストロマを生成する可能性を持っている。 一方、osterix+胚間葉系細胞や成体間葉系細胞は、限られた可能性しか示さない。 驚くべきことに、osterix+細胞とNestin-GFP+細胞の両方がH型毛細血管の近くに存在し、L型毛細血管周辺には存在しない。 レプチン受容体（LepR）を発現する類洞周囲間質細胞は、発生初期にマークされると骨系細胞への寄与が示唆された。 成体間葉系細胞にLepRが発現すると、脂肪形成能が促進され、骨形成能が抑制されることは注目に値する。 LepR+細胞は骨髄のC-X-Cモチーフケモカインリガンド12（Cxcl12）発現細胞に寄与している。 Cxcl12を発現するNestin陰性の間葉系細胞は造血幹細胞を支持する微小環境を提供する . 781>

血管周囲のMSPCとは対照的に、非血管周囲の細胞も骨系列細胞や骨髄間質に寄与していることが確認されている。 Col2-CreER系を用いた軟骨由来細胞のLineage Tracingでは、骨系細胞やCxcl12過剰の網状間質細胞を形成する可能性が示された。 同様に、Sox9-やAggrecan-CreERなどの他の軟骨形成系を用いた系譜追跡でも、複数の間葉系細胞を形成する可能性が確認された。 Gremlin1が骨軟骨系細胞のマーカーとして同定されたことは、MSPCプール内に異なる前駆細胞サブタイプが存在する可能性を示している。 Gremlin1+細胞は成長板と骨幹領域でクローン的に増殖しており、脂肪細胞への分化能を持たない。 これらの研究は、MSPCに不均質性が存在することを示し、集団内のサブタイプを理解し、その階層的関係を明らかにする必要があることを示すものである。 Vascular Nicheにおける間葉系ストローマ細胞の局在化

MSPCの局在化は、骨髄微小環境内の複数の領域がMSPCを支持しニッチを提供できることを示唆するものであった。 Col2+、Sox9+、Aggrecan+の細胞は、無血管領域である成長板に位置している。 Gremlin1+細胞は、成長板と骨幹の両領域に存在する。 Nestin-GFP+細胞は、動脈周辺と骨幹に存在する。 PDGFRβ+間葉系細胞はNestin-GFP+細胞と類似の分布パターンを示す . osterix+細胞の大部分は骨幹のH型血管の周囲に存在する． LepR+とCxcl12+細胞は主にL型（副鼻腔周囲）血管の周囲に局在している． 軟骨細胞は無血管領域に存在し、典型的には骨の成長板や骨端領域に存在する。 骨形成前駆細胞は、骨幹と骨内領域のH型血管の周囲に特異的に局在している。 脂肪細胞または脂肪細胞は、骨幹部の副鼻腔周囲に好んで存在する。 網状細胞は副鼻腔周囲のL型血管の周囲に局在している。 血管平滑筋細胞はαSMA+の動脈周囲細胞であり、骨髄微小環境中の動脈をしっかりと包んでいる . このように、異種間充織間質細胞の亜集団は、特定の血管亜型の周囲に優先的に局在し、特殊な血管微小環境の存在を示唆している（図2）

局所微小環境の支持において血管が果たす中心的役割を示唆する証拠がある。 タイプH血管における骨形成促進因子の高発現は、骨形成因子に必要な微小環境を作り出す。 骨内のタイプH毛細血管を促進することにより、骨形成細胞の数が改善される。 同様に、内皮から放出される血小板由来成長因子B（PDGF-B）は、間葉系細胞上に存在するPDGFレセプターと結合し、成長を媒介するシグナル伝達経路を活性化する . 骨内皮でPDGF-Bを過剰発現させると、骨髄でPDGFRβ+血管周囲間葉系細胞が増加する。 間葉系細胞は、VEGF、angiopoietin、FGF、BMPなどの血管新生因子も放出し、相互に関係しながら特定の骨髄微小環境を制御している

5. 造血幹細胞微小環境における血管＜4144＞＜3486＞5.1. 造血幹細胞維持における骨内皮細胞

原始造血と確定造血の両方において、ECと造血幹細胞の強い相互依存性が示されている。 当初は血栓形成、幹細胞の動員、ホーミングにおいてのみ、BM血管の重要性が認識されていた … 長期（LT）造血幹細胞が血管付近に出現することが確認され、骨髄血管ニッチを理解するために、この分野で非常に大きな関心を呼ぶようになった . 心臓や肝臓などの非造血器官からの培養ECはin vitroで造血幹細胞を維持することが確認されたが、腎臓からのECはこの可能性を欠いた。

IL-6ケモカインファミリーに結合する受容体のサブユニットである糖タンパク質130（gp130）を内皮特異的に欠失させると、骨髄が低細胞化し、造血幹細胞の数が減少することが明らかになった。 VEGFR2シグナルをブロック抗体で阻害すると、放射線照射後の洞房内ECの再生に重大な影響を及ぼした。 E-セレクチンは骨髄内皮にのみ発現しており、この遺伝子を欠失させると造血幹細胞の静止状態と放射線に対する抵抗性が高まることが示唆された . 直接的な細胞接触に加えて、ECはアンジオクリン因子と呼ばれる可溶性因子を放出して造血幹細胞の微小環境を制御していることが示された . Cxcl12と幹細胞因子（Scf）は、造血幹細胞のホメオスタシスを制御する重要なBM ECsのアンジオクリン因子であり、広く研究されている。 内皮細胞特異的にScfを欠失させると、造血幹細胞数が減少し、造血幹細胞移植時の再増殖能が低下した。 同様の研究で、ECのCxcl12の欠失は、造血幹細胞の枯渇とその長期再増殖活性をもたらした . 最近の研究では、ECのNotchシグナルの活性化により、造血幹細胞の微小環境の細胞成分とアンジオクリン成分の両方が拡大することが示された。 内皮のNotchシグナルは、新しいH型毛細血管、小動脈、PDGFRβ+血管周囲間葉系細胞、および細胞性Scfレベルの形成を促進した.

5.2. 造血幹細胞を長期間維持するための細動脈微小環境

細動脈のECとその周囲のNG2+間葉系細胞からなる細動脈微小環境は、静止状態の造血幹細胞を維持することが実証された . 同様に、洞様血管とその周囲のLepR+間葉系細胞も造血幹細胞集団を維持するための微小環境を提供することが示された。 別の研究では、α-catulin GFP+ c-Kit+ 造血幹細胞は、洞様血管とLepR+間葉系細胞が形成する洞様微小環境からなる中心骨髄領域に局在していることが示された。 また、静止期および分裂期の造血幹細胞にとって、洞周囲微小環境は1つであることを提唱している。 造血幹細胞は、細胞輸送とホーミングに関与する高浸透性類洞に比べ、低浸透性の動脈血管によって低ROSで維持されることが示された。 内皮Notchシグナルを介した動脈血管の増幅は、造血幹細胞ニッチの拡大をもたらし、その結果、若いマウスでは造血幹細胞の数が増加し、その機能も向上することがわかった . 最近、BMにおけるHoxb5の発現が、LT-造血幹細胞集団を区別するために同定された。 Hoxb5+造血幹細胞は、VE-cadherin+ECに直接結合しており、BM微小環境において血管と密接に関連していることが示された。 この研究では、Hoxb5+造血幹細胞近傍の血管微小環境に関する詳細な情報は得られていない。 骨髄微小環境に存在する複数の血管区画の文脈におけるHoxb5+造血幹細胞の局在を理解することは興味深い。 結論

骨血管系への関心が高まり、血管を操作することが骨髄微小環境を制御するかもしれないにもかかわらず、異種血管ニッチおよび内皮制御因子に関する我々の知識は、骨髄微小環境の血管媒介組織への洞察を得るためには限定的なものである。 表1は、骨内皮細胞で研究されている重要な因子とその特異的機能をまとめたものである。 骨血管系は非常に複雑で、異なる種類の血管から不均一に構成され、骨形成、造血および骨再生を制御する特殊な機能を備えていることが次第に明らかになってきた。 これらの異質な血管を形成するECは、放出されるアンジオクリン因子や周囲の細胞種とともに、骨髄における様々な微小環境の形成に寄与している。 さらに、毛細血管と微小循環の組織化によって生じる局所的な酸素状態が、微小環境の挙動と機能を制御している。 複数の因子や細胞種が関与していることから、局所ニッチの完全性を制御するための統制された制御機構が存在することが示唆される。 このような局所的な微小環境の細胞および分子構成要素を解明することは、骨における臨床的に重要な造血幹細胞およびMSCの理解を深めることになる。

骨量は加齢などの生理的変化や糖尿病、甲状腺機能低下症などの全身疾患により大きく変化する。 骨髄微小環境は、このような体内の生理的・病的状態に応じて変化する。 このような変化には、全身の生理機能の変化を補うために、骨髄区画内の特定の微小環境の増幅や減少が関与していると考えられる。 例えば、加齢に伴う生理的変化は、骨量の減少につながり、骨形成細胞にとって支持的な微小環境を提供するH型血管の消失と関連している 。 同様に、癌や転移の際にも、骨髄微小環境の変化が観察される。 これらの証拠は、骨髄微小環境の動的な性質が、局所的および全身的な要求と機能に基づいて変化していることを強く主張している。

骨髄における様々な微小環境の構築と調整に中心的役割を果たすECsは、骨の特定のニッチを操作する優れたターゲットとなる可能性を秘めている。 老化したマウスでH型血管を再活性化させると、新骨形成が促進され、骨量の増加につながる可能性がある。 治療への応用が期待されているにもかかわらず、骨血管系に関する知識は限られており、骨内の微小環境の組織化や局在化に関する理解に大きな影響を及ぼしている。 様々な生理的・病理的状態における骨髄構造の制御における血管の相互作用と役割を解明するためには、異質な血管とその内皮由来因子の特性、微小環境の細胞・分子構成要素に関するさらなる知見が不可欠である。

利益相反

著者は本論文の発表に関して利益相反がないことを宣言する。

謝辞

資金はウェルカム財団、王立協会、英国医学研究評議会から提供されました。