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通常、ヒトインフルエンザウイルスは上気道に感染してくしゃみや鼻汁、せきのほか、発熱や倦怠感、関節痛を引き起こす(22)。 また、スペイン（1918年）やアジア（1957年）のパンデミックに代表されるように、新しい亜型のインフルエンザウイルスがヒトに持ち込まれると、神経系の合併症も報告されています（2-4、6、10、18、22）
1997年に、家禽に由来するH5N1インフルエンザウイルスによってヒトでの流行が発生しました。 それ以来、世界中で500人以上がH5N1ウイルスに感染し、死亡率は約60%に達しています(21)。 ヒトのH5N1ウイルス感染は、一般に重症肺炎として現れ、急性呼吸窮迫症候群に進行する。しかし、一部のH5N1ウイルス犠牲者は、神経学的な病変を経験している(1)。 H5N1ウイルスのRNAと抗原は患者の脳から検出され、ウイルス自体も脳脊髄液から分離されている（5、7）。これらのデータは、H5N1ウイルスの一部が、スペインやアジアのパンデミックの初期に起こったように、ヒトに脳炎を引き起こす可能性があることを示唆している。
フェレットはインフルエンザウイルスに非常に感染しやすく、ヒトに見られるインフルエンザの症状のいくつかを発症するので、インフルエンザ感染の哺乳類モデルとして有用である(8, 12, 14, 16, 19)。 また、フェレットモデルにおいて、H5N1型インフルエンザウイルスの経鼻曝露による神経侵襲性が報告されている(23)。 そこで、H5N1ウイルス感染の長期的な神経学的影響を調べるために、これらの動物で軽い症状を引き起こすH5N1ウイルスをフェレットに感染させ、9カ月間中枢神経系（CNS）への影響を観察した。 また，これらのH5N1ウイルスが中枢神経系に侵入する経路の解明を目指した。
6カ月齢のフェレットにA/Hong Kong/483/1997（H5N1; HK483）またはA/Hong Kong/486/1997（H5N1; HK486）ウイルス106 PFUを経皮的に接種した。 これらのウイルスは、0.3％のウシ血清アルブミンを補充した最小必須培地中のMadin-Darby canine kidney（MDCK）細胞で増殖させた。 感染後3，6，12日目および1，3，6，9カ月目に組織標本を採取し，ウイルスの分離と病理学的検査を行った． フェレットは、最初の10日間は無気力で、呼吸器感染の徴候と症状を示したが、神経学的徴候を認めず、これは以前に報告された結果とは対照的であった(23)。 鼻甲介、肺、気管、脳、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、膵臓、および脊髄の組織サンプルを採取し、リン酸緩衝生理食塩水で10％懸濁液にホモジナイズした。 各組織のウイルス価はプラークアッセイを用いて測定した。 ウイルスは主に鼻濁音で複製され、ウイルス力価は3〜6日後までに105〜106PFU/グラムの組織に達した（表1）。 HK483またはHK486に感染したフェレットから採取した脳組織は、10％中性緩衝ホルマリンで保存し、パラフィン包埋のために処理した。 パラフィン包埋組織を5mm厚のスライスに切り出し、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）で染色した。 さらに，H5インフルエンザウイルスに対するウサギポリクローナル抗体で免疫組織学的に染色するために切片を切り出した． 組織学的検査により、脈絡叢の炎症を含む神経細胞の浸潤または損傷が明らかになった（表2）。 HK486ウイルスに感染したフェレットは、12日間持続する非支管性炎症（図1a）とウイルス抗原の発現（図1b）を示し、1ヶ月後にはウイルス抗原は検出されなかった。非支管性脳炎は3ヶ月間続き（図1c）、6ヶ月後と9ヶ月後には、初期の段階でウイルス抗原が検出された部分にグリアの瘢痕が残存している（図1d）が、このことは、ウイルス抗原が非支管性炎症に関与していることを示している。 さらに、HK486に感染したフェレットは、生後12日目に嗅覚系の巨視的な損傷を示した（図1eおよびf）。 これらの結果から、高病原性H5N1ウイルスは主に宿主の気道に影響を与えるが（1）、神経系の合併症も引き起こす可能性があることが示唆された。 HK486はフェレットの脳実質に侵入し、重篤な脳実質障害を引き起こしたが、H5N1第2株HK483は6日目のp.i.でフェレットの脳に明らかな脳実質障害を伴わない重篤な非吸収性血管炎を引き起こした。 血管内にウイルス抗原は検出されなかったが、血管傷害は内皮の腫脹（図2a、矢頭）、散在するアポトーシス細胞（図2b、矢頭）、マクロファージ（図2a、矢印）および多形核白血球（図2b、矢印）の壁内浸潤によって特徴づけられるように明らかであった。 血管病変は視床、灰白質と白質の接合部、脳幹にみられた。 1ヶ月後および6ヶ月後の脳標本では、視床、小脳、前脳のクモ膜下腔に慢性的な血管周囲出血を繰り返す出血性病変（図2c）が認められた（図2d）。 これらの所見は、毎年流行するインフルエンザウイルスによる脳出血性合併症の報告と一致している（11）。 ウイルス感染による二次的な脳血管炎は比較的多く(17)、血管壁の脆弱化が脳出血の原因である可能性が高い。 したがって、ヒトにおけるH5N1ウイルス感染は、他の神経栄養型ウイルスに感染した際に見られるのと同様の脳出血を引き起こす可能性があると結論付けるのは妥当であると思われる。
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HK483 または HK486 H5N1 ウイルスに感染したフェレットの組織からのウイルス回収率
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高病原性H5N1インフルエンザウイルス感染後の各時点におけるフェレットの脳病変の有病率a
HK486ウイルスに感染したフェレットの脳病変。 (a）感染後6日目（p.i.）の嗅覚野の重篤な非支管性脳炎。 (神経細胞およびグリア細胞は抗H5ウイルス抗血清で染色した。 (挿入図）非感染の神経細胞およびグリア。 (c) 生後3ヶ月の脳組織のくすぶり脳炎 (d) 生後9ヶ月の血管周囲のグリア瘢痕形成 (e) 生後12日目の嗅覚系の一部（梨状葉）にマクロ的に見える脳病変がある。 (f) 1ヶ月後のウイルス性脳炎による嗅球の部分欠損（脳の上側）。これらの画像を年齢をマッチさせたコントロールの脳（下側の脳）と比較してください。
HK483ウイルスに感染したフェレットの脳病変。 (a) 6日目の顕著な非支管性血管炎。周囲の脳実質の正常な外観と比較して、血管内皮細胞（矢頭）の重度の腫脹および血管壁へのマクロファージの移動（矢印）に注意する。 (b) 6日目の血管壁に散在するアポトーシス細胞（矢頭）と多形核白血球（矢印） (c) 6ヶ月目に剖検したフェレットの視床の古い出血病巣と新鮮な出血病巣（矢頭は古い病巣のヘモジデリンを含んだマクロファージ、矢印は赤血球を含んだ新鮮出血）……。 (d) 6ヶ月後のフェレット脳における新鮮なクモ膜下出血。
H5N1ウイルスがフェレットの脳に侵入する経路を調べるために，HK483，HK486，A/Hong Kong/213/2003 (HK213), A/Vietnam/1204/2004 (VN1204) および A/duck/Vietnam/NCVD-18/2004 (NCVD18) ウイルスに感染したフェレットの脳病変とウイルス抗原発現の分布を分析した． HK213，VN1204およびNCVD18ウイルスは，0.3％の牛血清アルブミンを添加した最小必須培地中のMDCK細胞で増殖させた． 6カ月齢のフェレットに106 PFUのウイルスを経皮的に接種した． 脳組織は急性期，VN1204とNCVD18については感染後3日と6日，さらにHK213については感染後12日に採取した． 組織は，H&E染色と免疫組織化学で処理し，組織学的検査を行った． VN1204，NCVD18およびHK213によって生じた脳実質の病変は，非吸収性脳炎によって特徴づけられ，ウイルス抗原の発現パターンはHK486のそれと本質的に同じであった（データは示していない）． 脳病変とウイルス抗原の3次元分布を理解するために、フェレット脳と構造が酷似しているキイロマングース（Cynictis penicillata）脳の3次元イメージング（TRI/3D-SRF2；ラトックシステムエンジニアリング株式会社、日本）によりプロットした(20)。 嗅覚経路（嗅覚の感覚経路）を可視化するために、嗅球から梨状皮質までの神経経路を3次元画像上の基準枠としてマーキングした（図3a、黄色、補足資料の動画S1も参照のこと）。 すなわち、嗅覚路にのみ分布するもの（図3bおよびc、黄色の破線；動画S2およびS3も参照）（HK213およびNCVD18）、嗅覚路に沿って検出されるもの（図3bおよびc、黄色の破線）、ウイルス抗原の有無による3種類の異なるH5N1インフルエンザウイルスによる脳病変のパターンを見いだした。 3d and e, dashed yellow line; Movies S4 and S5 も参照）、脳幹（Fig. 3d and e, white arrow; Movies S4 and S5 も参照）（HK486 and VN1204）、その他の領域（Fig. 3f; Movie S6 も参照）（HK483）で検出されたものである。 第3のグループの病変を他の2つのグループから分離する根拠は、病変の分布を後方から調べるとより明らかになる（図3g、h、黄色対青色対赤色）。 これらのマッピングの結果から、我々が検査したH5N1株のほとんどが嗅覚経路を経由して脳に侵入していることがわかった（図3、黄色の破線）。 例外は HK483 株 (Fig. 3f) で、フェレットでは明らかに脳血管系を標的とし、嗅覚系以外の病変を生じた
H5N1 ウイルス HK483、HK486、HK213、NCVD18、または VN1204 株の感染に伴う脳病変の分布。 キイロマングースの脳の3次元画像上に脳病変をマッピングした。 脳切片の一部分を解析したため、病変位置のプロットは不連続である。 (a)嗅覚ルート(黄色)。 HK213（b）またはNCVD18（c）感染に伴う病変とウイルス抗原（赤）の分布は、嗅覚ルート（黄色の破線）に沿っている。 HK486（d）またはVN1204（e）感染動物では、病変とウイルス抗原は脳幹（白矢印）と嗅覚ルート（黄色破線内の赤プロット）に分布している。 HK483株（f）では、重度の血管障害を起こし、明らかな出血性病変が見られた（青プロット）。 (g)嗅覚路の後方視（黄色のプロット）。 (h）HK483株による出血性病変（青色）および血管炎（赤色）の嗅覚路外側の後方視。 パネルaからfは腹面図。
H5N1ウイルスがパンデミックになる前に、おそらく人間の気道上部でよく増殖する能力を獲得しなければならず、それはくしゃみや咳による効率的なヒト-ヒト感染を導くだろう（13, 22）。 フェレットのデータから、もし高病原性H5N1ウイルスがヒトでこのような足場を得た場合、神経経路を経由して脳に侵入するか、脳血管炎を引き起こすことにより、不顕性神経学的合併症を引き起こす可能性があることが示唆された。 以前、フェレットの脳からH3N2ウイルスが検出されたが、脳内のウイルス量は少なく（102.2 log10 50%卵感染量以下）、脳内にウイルス抗原を認めたとの報告はない(23)。 我々は、2009年パンデミックH1N1ウイルスがフェレットの呼吸器内でヒト季節性H1N1ウイルスよりも効率的に複製し（9、13、15）、非吸収性嗅球病変を引き起こすことを発見したが、これらの動物の脳実質にウイルスは認められなかった（データは示されていない）。 したがって、ウイルス抗原の存在によって示されるように、脳実質への侵入はH5N1ウイルスの特徴である。 したがって、H5N1ウイルス感染患者における不顕性神経学的合併症について、レトロスペクティブおよびプロスペクティブな研究を行うことが適切であろう。 今回の知見は，H5N1ウイルスの世界的流行に伴い，重症呼吸器感染症に潜在的な神経学的合併症が併発する可能性を懸念させるものである
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