The fungicide azoxystrobin promotes freshwater cyanobacterial dominance through altering competition

Toxicity of AZ on green algae and cyanobacteria

Model cyanobacterium M. Azoxystrobinは淡水藍藻類を優勢にし、競争力を向上させる。 aeruginosaと一般的な緑藻C. pyrenoidosaを用いて、緑藻類とシアノバクテリアに対するAZの毒性を検討した。 M. aeruginosaは7日間の処理中、AZの濃度範囲によって成長が抑制されなかったが（Fig. 1a）、C. pyrenoidosaは7日後に試験した3つのAZ濃度で約9.2～30%成長が抑制された（Fig. 1a）。 C. pyrenoidosaの増殖は、低AZ濃度（5-10 μg L-1）および低初期藻類細胞密度（自然界の藻類密度に近い約2万個/mL）存在下で、20～30%有意に抑制された（Additional file 1: Figure S2）（p＜3586＞0.05）が、緑膿菌の増殖には同じテストAZ濃度において影響がなかった。 例えば、葉緑素のPseudokirchneriella subcapitataの成長に対する溶解したAZの毒性は、藍藻のAnabaena flos-aquae で報告された毒性の約500倍であった 。

AZのプランクトン群集への影響を調べるために、マイクロコズムを使用しました。 自然湖水から微生物をろ過により分離し、人工培地に移した後、様々な濃度のAZをマイクロコズムに添加した。 AZ処理後のマイクロコズムでは、Chl-aとフィコシアニンの濃度を測定した。 植物プランクトンの総体積を示すChl-a濃度は、対照区のマイクロコズムでは培養3日後に4 mg L-1に達し、植物プランクトンのブルームが発生した（Fig. 1b）。 試験した最低濃度（0.5 mg L-1）以上の濃度のAZに3日間暴露すると、Chl-a濃度が低下し、AZが緑藻類を構成する植物プランクトン集団に毒性を示すことがわかった（Fig.1b）。 Chl-a濃度は、マイクロコズムで試験したAZ濃度の範囲において、8.7%から37.3%減少した。 一方、シアノバクテリアのバイオマスの指標となる別の色素、フィコシアニンの生産量は、2.5 mg L-1 以上の AZ 濃度で 3 日間の曝露により増加した（Fig.1）。 このことから、AZはマイクロコズムにおいて藍藻の増殖を促進したことが示唆された。

水環境におけるアゾキシストロビンの分解速度は光によって刺激され、AZの水光分解DT50（50%消散までの時間）（pH 7）は8.7～13.9日であった。 興味深いことに、溶存AZ濃度は、緑藻類とシアノバクテリアに応答して経時的に異なる減少を示し、C. pyrenoidosaではM. aeruginosaよりも急速に減少した（Fig. 1d）。 このことから、同じ光学濃度で植菌しても、真核藻類であるC. pyrenoidosaはM. aeruginosaよりも多くの溶存AZを取り込んでいることが示唆された。 また、マイクロコズムにおける溶存AZ濃度の減少は、M. aeruginosaの培養物よりも速かった（Fig. 1d）。 マイクロコズムにおけるAZの枯渇は、マイクロコズムの主成分である緑藻類にAZが優先的に取り込まれること、およびシアノバクテリア以外の水生微生物にAZが多く吸着されることにより説明される可能性がある。 以上の結果から、C. pyrenoidosaはM. aeruginosaよりもAZに対して非常に感受性が高く、おそらくC. pyrenoidosaのAZ消費量（取り込み/吸着量）が高いことが一因と考えられた。

Transcripts proportion variation after AZ exposure whole plankton community

Meta-transcriptomic sequencingを行って、AZ暴露による全プランの転写変化を検討した。 メタトランスクリプトームシーケンスの結果の概要は、Additional file 1: Extended Resultsに記載されている。 また、異なる分類レベルの2つのグループにおける転写産物の分類学的比率を、Additional file 2に示した。 Dataset 2に、分類学的に注釈された転写産物の相対的な存在量（RAT）で表しました。 RAT値は微生物のバイオマスを表すものではなく、種間の転写活性の変化を表すもので、微生物群集の活発な代謝状態や機能を表している。

培養7日後の対照マイクロコズムにおけるRATの相対量は、主にMonoraphidium属（Chlorophyta属）に支配されていた（図2）。 しかし、AZ処理により、葉緑素門の主要な分類群の転写産物数はあまり影響を受けなかったにもかかわらず、葉緑素門のRATの相対存在量は対照区の63.6%からAZ処理したマイクロコズムでは35.8%へと減少した（図2a、追加ファイル1: 表S2）。 褐藻類と海藻類の他の真核藻類のRATの相対量も、AZで処理したマイクロコズムでは有意に減少し（p < 0.05）、珪藻類の存在量は6倍程度増加した（追加ファイル1: 表S2）。 一方、藍藻類（主にSynechococcalesで構成）のRATは、対照群の1.7%からAZ群の38.3%と、20倍以上劇的に増加した。 また、真核生物/原核生物の配列比は、藍藻が大幅に増加し、葉緑素が減少したことにより、AZ処理マイクロコズムでは3.1から0.9に減少した（Fig. 2b）。 AZ処理マイクロコズムにおける藍藻の増加は、Synechococcalesの割合が高く、Chroococcalesの割合が低いことと関連していた（図2d）が、AZは真核生物の主要部門であるChlorophyta内の目の相対存在量に影響を与えなかった（図2c）。 Synechococcale目内の藍藻は、有毒なブルームを形成し、真核藻類の競合に影響を与える可能性がある。

AZはMonoraphidium sp.とSynechococcus sp.の単培養を阻害した

MonoraphidiumのRATが半減し、Synechococcus sp.のRATが半減したことから、AZは単培養におけるSynechococcus sp.とMonoraphidium sp.の両方を阻害した。 AZ処理後、Synechococcus sp.とMonoraphidium sp.のバッチ培養におけるAZ毒性バイオアッセイを実施し、マイクロコズムにおけるAZ添加が競合する緑藻類（Monoraphidium sp.）よりも藍藻類（Synecococcus sp.）を優先的に利するとする仮説を強化することができました。 興味深いことに、BG-11 培地における Synechococcus sp.の単培養体の成長は、初期 AZ 濃度 2.5 mg L-1 に 7 日間暴露すると約 28% 阻害されたが (Fig. 3a) (p < 0.05) 、4 日間の暴露では大きな影響はなく (p=0.21) 、Synechococcus sp. は高濃度の AZ に長期間暴露すると成長が阻害されることが示唆された。 一方、Monoraphidium の培養では、2.5 mg L-1 AZ（初期濃度）に 7 日間暴露した後、細胞収量が約 45%抑制された（図 3b）。 以上の結果から、Monoraphidium sp.はSynechococcus sp.よりもAZに対して感受性が高く、AZ処理したマイクロコズムではSynechococcus sp.が著しく増殖に有利であることがわかった（Fig. 2d）、AZが間接的にSynechococcus sp.に利益を与えていると考えられる。

共培養においてAZはMonoraphidium sp.を抑制し、Synechococcus sp.に利益をもたらす

2つの藻類を共培養する場合、AZを添加するとSynchococcus sp.に利益をもたらすことが分かった。 この結果は、メタトランススクリプトーム解析のRATの結果と一致した（Additional file 1: Figure S3）。 富栄養化した湖水で7日間培養したところ、細胞数比（Synechococcus/Monoraphidium）はAZ処理により向上し、対照の1.2から、25μg L-1, 250μg L-1, 2.5mg L-1 AZ処理でそれぞれ2.3, 3.6, 7.7 となった（図3C-f）。 改変BG-11培地における原核藻類および真核藻類の増殖結果（追加ファイル1：図S3）は、富栄養化した湖水と同様であり、AZ処理ではSynechococcus属が優勢になることが確認された。 自然水中では、アレロパシー相互作用やポジティブフィードバックなどのいくつかの要因によって、緑藻類とシアノバク テリアがバランスをとって存在している。 AZの存在は、おそらく緑藻類の代謝を変化させることでこのバランスを崩し、共培養においてモノラフィジ ウム属よりもシネコカス属の成長を促した（Fig. 3c-f）。 AZ処理後、Synechococcus sp.の細胞数は共培養で約1.5倍に増加し（図3c-f）、Synechococcus sp.のRATはマイクロコズムでコントロールに比べて20倍以上増加した。 RATは細胞密度と容易に比較できないため、実験室とマイクロコズムの実験を定量的に比較することは困難である。 しかし、どちらの実験も、AZが緑藻類との競合を変化させることでシアノバクテリアの成長を促進することを示唆している。

AZ changes the transcriptional activity of fungi, viruses, bacteria, and zooplankton

Zygomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, and Ascomycotaなどの菌類のRATはすべてAZの殺菌作用によりコントロールと比較してAZに暴露後著しく減少（p < 0.05） (Additional file 1: Table S2)しました。 また、酸素を生産せず嫌気環境を好む光合成細菌を含むクロロビ門のRATも、AZ処理マイクロコズムで有意に（〜8倍）増加した（p < 0.05）ことは特筆に値する。 AZ処理マイクロコズムでは、溶存酸素濃度はコントロールに比べて過飽和状態に保たれていたが（Additional file 1: Figure S4）、微生物（おそらくシアノバクテリア）凝集体を取り巻く無酸素状態のマイクロゾーンがAZ処理マイクロコズムでよく発達していると考えられ、これはChlorobiのRAT上昇と一致すると思われる。 動物プランクトンのRATは、節足動物門、線虫門、刺胞動物門などほとんどの門で、AZ処理により対照群に比べ て減少したが（Additional file 1: Table S2）、アカントアメーバなどいくつかの属では逆に減少した（Table 1）。 一般に、動物プランクトンの一部（節足動物のミジンコなど）、菌類（ツボカビ類）、従属栄養細菌（Cytophaga、Bdellovibrio）、ウイルス（Podoviridae、Siphoviridae、Myoviridae）のRATはAZ処理マイクロコズムにおいてコントロールと比較して著しく低下（p < 0.05）した（表1, 図4）。 上記の浮遊性生物は、藍藻を捕食、寄生、溶解し、藍藻の現存量を制御する役割を果たすため、AZ存在下で藍藻が一部優占することを説明できるかもしれない。 また、動物プランクトンの相対的な存在量の減少は、食用の葉緑素が減少し、食用でないシアノバクテリアが増加したことを反映している可能性があります。

非食用藍藻と動物プランクトンをつなぐ菌類動物胞子が重要な役割を果たすことも知られている。 節足動物（クラドセランや橈脚類）はデノボステロールを合成できないので、餌から見つけなければならない。 例えば、ツボクサの胞子は、ミジンコが糸状シアノバクテリアを食べるときに必要な補食となります。 殺菌剤 AZ は真菌を強く阻害するため、おそらく真菌の胞子が減少し（表 1）、藍藻を食害するミジンコが減少して、ミジンコの増殖が減少し（表 1）、藍藻が増殖して、藍藻が食害されないように保護した可能性があ ります。 動物プランクトン群集もシアノバクテリアのウイルスや寄生虫も、シアノバクテリアのブルームを制御することはできないと思われた。 しかし、それらは食物網の構造を修正することで水系に安定性を与え、微生物群集に影響を与えるだけでなく、シアノバクテリアのブルームに寄与する可能性がある。

Metabolic pathway in eukaryota and bacteria in response to AZ treatment

Chlorella 属や他のChlorophytesでは全体的にトランスクリプトーム注釈情報が限られているので、微生物群集全体のメタトランスクリプトーム解析は、浮遊生物と藍藻の相互作用をさらに理解するのに助けとなりました。 機能アノテーションの概要はAdditional file 1: Extended Resultsに、詳細な機能バリエーションはAdditional file 2に記載されています。 Dataset 3, 4に掲載しています。 真核生物と細菌の配列を区別し、KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) level 3 で解剖した。 図5は、真核生物と細菌の転写産物（前項で述べた4つの代謝系に属する）の相対存在量に基づく最も重要な40のパスウェイを示す。

真核生物の構成比率はAZによって大きな影響を受けないにもかかわらず（追加ファイル1：図S5a）、KEGGレベル3の経路はしばしば著しい影響を受けていた（追加ファイル2：データセット4）。 図5aに示すように、真核生物においてAZの存在により最も高発現したパスウェイは、植物ホルモンシグナル伝達、MAPKシグナル伝達経路、窒素代謝、ユビキチンを介したタンパク質分解、グリセロリン脂質代謝であり、最も低発現だったパスウェイはポルフィリンおよびクロロフィル代謝、酸化的リン酸化、ペルオキシソームであり、AZは真核生物の機能遺伝子発現を調節することが示された。

シアノバクテリアブルームに応答して、細菌群集構造と代謝経路の相対的な存在量が劇的に変化した（図5bおよび追加ファイル1：図S5b）。 図5bに示すように、カロテノイド生合成（コントロール比＋1326％）、光合成アンテナタンパク質（＋1305％）、光合成（＋758％）など、シアノバクテリアと密接に関連する経路が有意に過剰発現した（p＜3586＞ 0.05）。 また、抗生物質、ビタミン代謝、多糖類合成に関連する相対量が低い（< 0.05）パスウェイの多くがAZに応答して発現が異なることに注目した（追加ファイル2：Dataset 4）。 これらの機能については後述する。

1. AZによる酸化的リン酸化と光合成のモジュレーション。 真核生物と原核生物の酸化的リン酸化に関連する遺伝子の相対発現量は、AZ処理微小生態系において劇的に減少し、その抑制の程度は両者で同等、すなわち対照に比べて約42％であった。 ミトコンドリア膜や葉緑体膜に存在するF-ATPaseをコードする遺伝子（atpA, atpB, atpD, atpF）は、真核生物、細菌ともに有意に低発現（約40~80%減）した（p < 0.05）。 このF-ATPaseの転写低下は、AZがチトクロームbとチトクロームc1間の電子伝達複合体を阻害し、ミトコンドリア呼吸とATP産生を減少させる毒性作用によって説明されると考えられる。 光合成代謝経路に関しては、AZ処理後の光化学系転写産物の変化は、真核生物と細菌で異なっていた（Additional file 1: Figure S6）。 バクテリアでは、フィコビリソームに関わる遺伝子（例：apcD, apcE, cpeC, cpeZ）が強く過剰発現した（約4-32倍）。一方、真核生物では、光捕集複合体のタンパク質（例：LHCB2、LHCA1）の転写はほとんど変わらなかった（追加ファイル2：データセット5）。 これは、AZ処理したマイクロコズムで藍藻が増加したことと一致する。 しかし、バクテリアは、AZ の存在下で起こりうる環境ストレスから細胞を守る酵素をコードする NAD(P)H-quinone oxidoreductase 遺伝子（ndhD、ndhF、ndhH）が強く増加（10-24 倍程度）し、AZ 毒性を低減する解毒機構を持っていると思われることは注目すべき点であろう。 さらに、原核生物はカロテノイド生合成の増加（1326％増）およびグルタチオン代謝（344％増）を通じて活性酸素を解毒し、細胞の修復（ミスマッチ修復に関わる遺伝子、211％増）を改善すると考えられる .

2. 多糖類の合成と分解。 真核生物の多糖類生合成に関連するいくつかの遺伝子の転写が増加し（Additional file 1: Table S3）、例えばリポポリサッカライド生合成の経路の遺伝子（＋353％）などが挙げられた。 また、多糖を細胞外に輸送することが知られている多糖関連システム（ABCトランスポーター、+162%）もAZ群、コントロール群ともに過剰発現していた。 植物プランクトンでは、ストレス環境下で多糖の合成が促進されることが報告されている。 一方、細菌では、糖鎖合成に関連する4つのパスウェイ（N-Glycan biosynthesis, various types of N-glycan biosynthesis, lipopolysaccharide biosynthesis, and peptidoglycan biosynthesis）の発現が63-77%程度有意に低下したが (p < 0.05)、AZ 処理したマイクロコズムでは「その他の糖鎖分解」というパスウェイがコントロールに比べて〜10倍に過剰発現していることが明らかにされた。 原核生物における多糖合成の減少がシアノバクテリアでも起こったと仮定すると、シアノバクテリアにおける多糖バラストの推定上の減少は、シアノバクテリアを湖面に維持し、ブルーム中に深さとともに強く減衰する光を利用するのに役立つ可能性がある。 Synecocchococus属を含むいくつかのシアノバクテリアは、実際に多糖合成を通して浮力を調節することが示されています。

3. ビタミン生合成の調節と細菌と真核生物の間の潜在的相互作用。 真核生物では、ビタミンB群の生合成に関連するすべての経路（例えば、チアミン、リボフラビン、ナイアシンアミド、パントテン酸、ビタミンB6、ビオチン、リポ酸、葉酸）が、AZ処理したマイクロコズムではコントロールと比較して過剰発現（14~243％）した（追加ファイル1: 表S4）。 一方、細菌では、葉酸、ニコチンアミド、チアミンの生合成に関連する生化学経路がAZ曝露後のマイクロコズムで過剰発現（37~139%）、相対的に存在量の低いビタミン生合成経路（すなわち, ビオチン、リポ酸、リボフラビン、B6）は、コントロールと比較してAZ処理マイクロコズムでは有意に発現が低下した（22~68%, p < 0.05）（追加ファイル1: 表S4）。 興味深いことに、細菌では、ビタミンB12（コバラミン）の輸送に関与する2つの遺伝子（すなわち、btuBまたはK16092：ビタミンB12トランスポーターおよびbtuFまたはK06858：ビタミンB12輸送系基質結合タンパク質）の相対量が、コントロールに比べてAZ処理マイクロコズムでそれぞれ88％および57％減少した（追加ファイル2：データセット5を参照のこと）。 真核生物（菌類や多くの葉緑素を含む）の中には、コバラミンをデノボで合成できず、このビタミンを獲得するためにバクテリアとの相互作用に依存しているものがあることから、今回の結果は、少なくとも部分的には、バクテリアと真核生物の間のビタミンB12相互交換が減少したことによって藍藻の増加が説明できるかもしれないという仮説を支持するものであった。

AZ は真菌、真核藻類、シアノバクテリアの相互作用を変化させた

我々の結果は、真菌または真核生物と原核生物の間のアレロパシー相互作用と一致し、シアノバクテリアのブルーム動態に影響を与える可能性を示した。 第一に、藍藻の細胞溶解を促進するいくつかの二次代謝産物を生産する多くの真菌の相対的活性の低下が報告され、藍藻を有利にする可能性がある。 また、真核生物の抗生物質生合成経路（モノバクタム生合成（1524％増）、ペニシリン・セファロスポリン生合成（161％増））は、AZ暴露下で1.6～15倍程度優先的に発現していました。 このことは、真核微生物がシアノバクテリアの増加に対して、抗菌性化合物の生産で対応する可能性を示唆しているが、これによってシアノバクテリアの発生を防ぐことはできないと思われる。 第三に、Additional file 1.に示すように Figure S7 に示すように、太湖の我々のサンプリング地点では、細菌群中の藍藻の相対存在比は 39.3%（16S rRNA 遺伝子配列のデータから導出）でしたが、対照群および AZ 処理群の7d培養後の細菌中の藍藻の RAT はそれぞれ 7.1% および 72.1%となり ました。 これは、緑藻類の割合が多いこと（図3c）が、富栄養条件下でも藍藻類の活動を制限する可能性を示した。

Long-term potential impact of short-term AZ contamination

追加ファイル1に示したとおりである。 図S8に示すように、50日間の培養後、藻類と有機物がマイクロコズムに沈殿し、対照群では透明になっている。 しかし、AZ群ではまだ藻類のブルームの典型的な特徴が見られ、緑色で濁っているように見えた。 この興味深い現象は、AZの濃度がマイクロコズムで15日後に検出限界以下になったものの（図1d）、初生段階での高い変動が50日後まで影響を持続させることを示している（追加ファイル1：図 S8）。 AZの残留物は水環境中に広く検出されたことから、これらの水域はかつて短期間に高濃度のAZ汚染に見舞われた可能性がある。 また、溶存AZはマイクロコズム内で急速に減少し（図1d）、藻類培養15日後には検出限界以下となったことから、溶存AZはマイクロコズム内で速やかに消失していることが示唆された。 自然水系では、AZはプランクトンに取り込まれたり、有機物表面や堆積物に吸着されたり、生分解や光分解によって散逸したりする。 したがって，AZのピーク濃度は，湖沼，河川，地下水などで検出される溶存濃度（0.01～29.70 μg L-1）よりもはるかに高いと予想され，実験に用いた濃度に近い殺菌剤が一過性に発生し，長期的に悪影響を及ぼす可能性があることが示唆された。 例えば，適用圃場周辺の地表水からは，0.27～2.52 mg L-1の範囲で殺菌剤チラム® の残留が検出された。 さらに，AZと相互作用する他のさまざまな殺菌剤が水系に存在し（多くは堆積物に吸着），堆積物の再固定化によって再び表流水に放出される可能性がある ……このように，AZと相互作用する殺菌剤は，水系に存在し，堆積物の再固定化によって再び表流水に放出される可能性がある。 このことから、環境中のAZ濃度が高い場合（少なくとも散発的）には、水生微生物に毒性を示し、逆説的にシアノバクテリアの成長を促進する可能性がある。

農業地域に近い水域では常に殺菌剤の汚染と栄養分の過剰蓄積が共存し、シアノバクテリアがよく発生する。 降雨後の農耕地近くの限られた水域で富栄養化とAZ汚染物質が同時に発生し、微生物群集構造の劇的な変化を引き起こし、藍藻のブルームを促進すると推定される。 これらの藍藻は、次の降雨の後に他の水域に移動する可能性がある。 そして、汚染された水域の群集構造を変化させ、近隣の水域の富栄養化を助長することになるのです。 微生物の生態系ネットワークは独自のバランスを持っていることが知られており、富栄養化によってそのバランスが変化する可能性があります。 本研究は、殺菌剤が複雑な群集ネットワークの相互作用を通じてHCBを促進する重要な役割を担っている可能性を示している

。