膜アデニルシクラーゼと活性化Gタンパク質の構造｜Science

The architecture of a signaling hub

Adenylyl cyclase (AC) respond to the various input to generate signal molecule cyclic adenosine monophosphate. ACはGタンパク質によって制御され、上流の受容体によって活性化される。 Qiらは、活性化Gタンパク質αsサブユニットに結合したウシ膜AC9の構造を、低温電子顕微鏡により3.4オングストローム分解能で決定した。この構造から、膜貫通ドメインと触媒ドメインをつなぐヘリカルドメインを含む、AC9の全構造が明らかになった。このモデルは、自己抑制のメカニズムを示唆するなど、ドメインがどのように相互作用して酵素活性を制御しているかを明らかにするものである。 Gタンパク質共役型受容体から受け取ったシグナルは、Gタンパク質を介してACに伝えられ、細胞内の環状アデノシン一リン酸（cAMP）濃度を調節する。本稿では、活性化Gタンパク質αsサブユニットと結合したウシ膜AC9の低温電子顕微鏡による構造を3.4オングストローム分解能で記述する。この構造から、AC9の膜ドメインと触媒ドメインにまたがるヘリカルドメインの構成が明らかになった。触媒ドメインのカルボキシル末端延長部は、AC9の触媒部位とアロステリック部位の両方を閉塞し、基質や活性剤と結合した状態とは異なるコンフォメーションを誘導し、cAMP生成における制御的役割を示唆している。

膜貫通型アデニル・サイクラーゼ（AC）は哺乳類のシグナル伝達における重要なタンパク質で、細胞外および細胞内の多くの合図に反応し、環状アデノシン一リン酸（cAMP）を生成して下流のシグナル伝達イベントに幅広く利用しています（1、2）。膜ACは、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）からの入力、細胞内Ca2+濃度の変化（3）、脂質シグナル伝達カスケード（4）など、複数のシグナル伝達カスケードを統合している。哺乳類には9種類のACサブタイプがあり、AC1〜AC9に分類される(5)。アミノ酸配列に基づくと、すべてのACサブタイプは、全体的に同じ構造であることが予測される。 ACは12本の膜貫通ヘリックスからなり、細胞質側のN末端とC末端を持つ多細胞膜タンパク質である。 ACポリペプチドの最初の6つのTMドメイン（TM1-TM6）は、触媒ドメイン（C1a）を含む細胞質領域に続き、C1bドメイン、第2のTM領域、TM7-TM12束、そして第2の触媒ドメイン（C2a）およびC末端のC2bドメインが続く。 N末端とC末端の部分は非常に多様であるが、最も保存されているのはクラスIIIヌクレオチドサイクラーゼに属するC1aドメインとC2aドメインである（5, 6）。キメラAC5C1/AC2C2と刺激性Gタンパク質サブユニットGαsとの複合体のX線結晶構造解析により、AC触媒装置の主要な特徴が明らかになり、Gタンパク質依存性ACによるcAMP生成の詳細な機構の定式化に役立った（7, 8）。しかし、哺乳類の膜ACはそれぞれ、膜スパンドメインやヘリカルドメイン（HD）などの付加的な構造要素を含んでおり、これらはこれらのタンパク質の正しい組み立てや酵素機能に重要である。

最初の哺乳類ACのクローニングとともに、ACはトランスポーターに似ているのではないかという提案がなされた（9）。ゾウリムシのACの初期の研究では、タンパク質のTM部分がイオンチャネル機能を持つ可能性が示唆された(10)。ゾウリムシのACのTM部分の配列は、電位依存性カリウムチャネルの配列と相同であり、チャネル機能を持つことが確認された(11)。ポリトピックTMヘリックスバンドルと細胞質アデノシン5′-三リン酸（ATP）結合ドメインの存在は、ATP結合カセット（ABC）トランスポーターとの表面的な構造・機能の類似性を示唆するものであった。しかし、ACと既知のトランスポーター様タンパク質やイオンチャンネル様タンパク質との間には、実質的な配列の類似性はない。マイコバクテリアおよび哺乳類のACの研究により、酵素の正しい組み立てにTMドメインが関与している可能性が示された（7, 12, 13）。しかし、TM領域の構造的、機能的な役割はまだ不明である。

AC9 は肺、脳、心臓など多くの組織で発現しているサイクラーゼのサブタイプである（14, 15）。また、A-kinase anchoring protein (AKAP) 複合体との関連も広く研究されている (16)。 AC9 は AKAP Yotiao を介して IKs カリウムチャネル、プロテインキナーゼ A、ホスホジエステラーゼ PDE4D3、プロテインホスファターゼ PP1 と結合することが提案されている (17)。 AC9は喘息の創薬標的として同定されており(5)、Ile772→Met変異をもたらすAC9の多型であるrs2230739は、吸入コルチコステロイドBudesonideに対する反応の変化と関連している(18)。 AC活性化の典型的なモデルでは、フォルスコリンが触媒部位に隣接するアロステリック部位に結合し、酵素を活性化させる。グアノシン5′-三リン酸（GTP）結合状態でのACとGαsサブユニットとの相互作用もAC活性化につながり、フォルスコリンとGαsタンパク質の両方の存在下で最大のAC活性化が達成された。しかし、他のACとの配列比較から、AC9にはアロステリック部位があり、フォルスコリンがAC9を活性化することが示唆された過去の報告もあるが（14）、いくつかの研究ではAC9はフォルスコリン非感受性であると結論付けられており、AC9はフォルスコリン非感受性タンパク質として独自のカテゴリーに立つというのがこの分野の総意となっている（19、20）。

ACは長い間、シグナル伝達の理解において欠落していた。おそらく、生化学的および構造的研究のためにこれらのタンパク質を発現および精製することが困難であると認識されているからである(21)。このギャップを埋めるために、我々はウシAC9とGαsの複合体（AC9-Gαs）の構造を低温電子顕微鏡（cryo-electron microscopy）と単粒子解析法を用いて決定した

ウシAC9を発現・精製し（図S1A）、cAMP蓄積アッセイを用いて機能完全性を確認した（図1、A〜C）。精製したタンパク質はATPからcAMPへの変換を触媒し、阻害性AC基質アナログであるMANT-GTP（2ʹ-3ʹ-O-（Nʹ-methylanthraniloyl）guanosine-5ʹ-O-triphosphate）で阻害することができた（図1B）。このタンパク質をGTPγS活性化Gαsと再構成すると（図S1、BおよびC）、シクラーゼが強力に活性化された（図1A）。普遍的なAC活性化物質であるフォルスコリンのin vitroにおけるAC9の活性化能力を試験したところ、サブミリモル濃度ではAC9の活性化は非常に弱かった（Fig. 1A）。一方、フォルスコリンはAC9-Gαs複合体を111μMの中央有効濃度（EC50）で活性化することができた（図1Aおよび表S2）。このように、フォルスコリンとGαsサブユニットはともにタンパク質を部分的に活性化することができるが、2つの薬剤を組み合わせることによってのみ完全な活性化に到達することができることが示された。さらに、ACのアロステリックモジュレーターとして予想されるように、フォルスコリンはAC9基質アナログMANT-GTPの阻害濃度中央値（IC50）を低濃度側にシフトさせた（図1、BおよびC）。したがって、精製した全長AC9とGαsタンパク質を用いたin vitro実験から、フォルスコリンは古典的なアロステリック活性化因子としてAC9-Gαsタンパク質複合体に作用することが明らかになった。

図1 AC9-Gαs 複合体の機能と構造

（A）AC活性測定（cAMP定量による）により、in vitroではAC9がGαsで活性化し、Fskによってさらに促進されるがGαsサブユニットに結合したときのみであることがわかる。 (B と C) AC9 (B) と AC9-Gαs (C) のフォルスコリン (0.5 mM) 非存在下および存在下での MANT-GTP 抑制アッセイ。 (DおよびE）AC9-Gαs複合体の低温電子顕微鏡密度マップ（D）により、複合体の完全な分子モデル（E）を構築し、その主要構造要素である膜貫通ドメインバンドル（TM）、ヘリカルドメイン（HD）、AC9の触媒ドメイン（C2a）およびGαsタンパク質（Gαs）を明らかにすることができた。 AC9とGαsタンパク質に対応する密度マップとモデル要素は、それぞれオレンジと緑で色分けされている。洗剤と未割り当てのタンパク質密度は灰色で表示されている。図3 Gαs結合AC9の構造は、これまで報告されていない閉じた構造である

（A）AC9触媒ドメインの図に、ヌクレオチドとフォルスコリン結合部位の閉じた密度（SOLマップ、マリン）を重ねた。 MANT-GTPとフォルスコリンの予想位置はAC5C1/AC2C2/GαsのX線構造（Protein Data Bank ID: 1U0H）に基づく。 (B）フォルスコリン非存在下での可溶性ドメイン低温電子顕微鏡マップにおける閉塞密度の類似図（SOL-Mマップ）。 (C）SOL-C密度マップにおいて、閉塞密度はC2aドメインのC末端（アスタリスク）に明確に連結している（C2b、青色メッシュ；Cα、赤色）。 (D)AC9と切断型AC91250のドメイン構成。 (E）野生型と切断型AC9変異体は、Gタンパク質非存在下で同様の酵素活性を示す。 (F）AC9とAC91250は共にGTPγS活性化Gαによって強力に刺激され、AC91250はATPに対するKmが著しく減少していることがわかる。 (G) MANT-GTPとフォルスコリンに結合したAC91250-Gαsの3D再構成図（AC91250-Gαs-MF）には、2つのリガンドに対する密度（マゼンタ）が示されている。 (H）AC91250-Gαs-MF複合体のモデルの同じ図。

MANT-GTPおよびフォルスコリンの存在下で、これら二つの化合物のIC50およびEC50値を超える濃度（各リガンドについて0.5mM）のAC9-Gαs複合体を含む凍結水和低温EMグリッドを準備し、単一粒子の低温EM分析（図S2）に供した。最適な粒子のサブセットにより、サイクラーゼとGタンパク質サブユニットの完全な複合体に相当する密度マップが得られ、3.4 Åの分解能で精製された（Fig. 1D）。この密度マップと、複合体の膜包埋部分（図S3）および細胞質部分（図S3）の精密化によって得られたマップを合わせて、AC9-Gαs複合体の完全な3次元（3D）モデルを構築することができた（図1E）。すなわち、（i）AC9の12-TMドメインバンドル、（ii）TMバンドルとAC9の触媒ドメインをつなぐHD、（iii）GTPγS活性化Gαsサブユニットと結合したAC9の触媒ドメイン（図1E）である（図1E）。 428＞このタンパク質のTMドメインは擬似2回対称性を持っており、抵抗性結節部、ABC、メジャーファシリテーターファミリーの溶質トランスポーターによく見られる特徴を持っている（図2、A〜C）。膜貫通ヘリックスTM1-TM6とTM7-TM12は176残基にわたって3.4Åの二乗平均平方根偏差（RMSD）で重ね合わせることができる（Fig. 2D）。この内部疑似対称性は、哺乳類の膜ACが、おそらく結核菌の「ハーフサイクラーゼ」Cya/Rv1625cと同様の単純なシステムから遺伝子重複イベントによって生じたという仮説を支持するものである(12)。 AC9の2つのTMハーフの間の界面は、TMドメインバンドルのN末端「半分」のヘリックスTM1、TM4、TM6と、タンパク質のC末端部分のTM7、TM10、TM12によって形成されている（図2、B、C）。哺乳類初のAC遺伝子のクローニングは、その一次配列からACがトランスポーターとして働く可能性を示唆するものであった(9)。今回の構造解析では、AC9のTMヘリは密接に配置されており、TMドメインバンドル内の溶質輸送経路と考えられるものは明らかにされていない。図2 AC9の膜貫通領域とHDの構造

(A) 低温電子顕微鏡構造から明らかになったTMドメインのトポロジーを示す。点線は密度マップに存在しない領域（細胞外ループ）、またはモデル構築に適さない不十分な密度として存在する領域を示している。 (BとC）AC9の膜包埋部分は2つの擬似対称な半分（TM1-TM6とTM7-TM12）からなり、これらの2つの半分の中の対応するヘリの配置はほぼ同じである（すなわち、TM1-TM7、TM2-TM8など）。らせんは密に詰まっており、構造には輸送機能を示唆するような転位経路の実質的な空洞は見られない。破線は、密度の低い地図特徴のために構築できなかった構造の要素を示している（B）。 (D) ウシAC9の膜に埋め込まれた部分の2つの部分（TM1-TM6とTM7-TM12）は、RMSD3.4Åで構造的に重ねることができる。 (E) AC9のTM1-TM5（オレンジ）およびTM7-TM11（黄色）領域が鍵となるTM6/TM12を包んでおり、これら二つのヘリの正しい配置に必要と思われる制約を提供している。 TM6とTM12は細胞質まで伸び、HD1とHD2の2つのヘリックスh1.1とh2.1（赤色）となる。 (F) HDは11残基のコイルドコイルによって安定化されており、アミノ酸側鎖の棒グラフは “cc “と表示されている。相同なヒトのサイクラーゼであるAC5と網膜グアニルサイクラーゼ（retGC1）のHDは、疾患に関連した変異を持つことが示されてきた。顔面ミオキミアを伴う家族性ジスキネジアに関連するAC5の変異は青い球で、レーバー先天性黒色障害-1に関連するretGC1およびCORD6の変異は紫の球で示されている。

AC9のTM6とTM12ヘリは細胞質まで伸び、ここではHD1（ヘリックスh1.1とh2.1を含む）とHD2（ヘリックスh2.1とh2.2；図2、EとF）と呼ぶ40残基のHDを形成している。この領域は、原核生物および真核生物のACやグアニリルシクラーゼの機能にとって重要である(12)。ヘリックスh1.1のLeu323からMet333残基とヘリックスh2.1のIle1022からLeu1032残基は古典的なコイルドコイルを形成している（図2F）。我々は、結核菌Rv1625cと相同性のあるMycobacterium intracellulareの膜ACであるCyaのHDを以前に報告した(12)。 AC9のHDは、Cyaと比較して、触媒ドメインとの境界におけるコア領域の相対的な配置にいくつかの違いが見られる（図2、E、F、および図S7、A、B）。 M. intracellulare Cyaでは、短いヘリックスがコイルドコイルのC末端でしっかりと結合している（図S7B）。一方、AC9のコイルドコイルは、h1.1とh2.1のC末端でほどけている（図2F、図S7B、図S8A）。この領域は、ACやグアニリルシクラーゼの機能にとって重要である。遺伝子疾患関連変異は、家族性ジスキネジアや顔面ミオキミアではAC5のHDに、Leber先天性黒色症-1（24）や錐体-ロッドジストロフィー-6（CORD6）では網膜グアニリルシクラーゼ（retGC1）にマッピングされている（22, 23）。現在では、M. intracellulare Cyaと比較して、ヒトの病態に関連したヌクレオチドサイクラーゼにはるかに近いウシAC9の構造を用いて、疾患と関連した変異の位置を精密化できる。

哺乳類のACにおける12-TMバンドルの機能はこれまで不明であった。最近のマイコバクテリアのRv1625cの研究では、マイコバクテリアのホモログの膜スパン領域の受容体機能の可能性が示唆された(12)。 AC9の細胞外表面の一部を分離することができず（図2、AおよびB）、タンパク質の膜結合部分が仮説的リガンドに対する機能的に関連する結合部位を保持しているかどうかは不明である。同様に、触媒ドメインC1aとTM7をつなぐC1bドメインは、我々の再構成では解像できなかった（図S6、E〜G）。しかし、この構造から、膜貫通領域との相互作用がタンパク質の触媒機能にどのような影響を及ぼすかを知る手がかりを得ることができた。 TM6とTM12はHDのh1.1とh2.1と連続している。 TM6とTM12はTM1-TM6とTM7-TM12らせん束の界面に位置し、脂質二重層に側方から露出している（図2Eおよび図S8B）。 TM6やTM12が脂質や小分子、他のタンパク質と直接相互作用することで、ヘリックスh1.1やh2.1の向きを変え、触媒ドメインに直接影響を与える可能性が考えられる（図S8B）＜1330＞＜428＞AC9触媒ドメインの全体はC1aおよびC2aという二つの半身からなり（図1E、3A）、以前に解いた膜ACの可溶性ドメイン（図S7、AおよびC）と同様のX線構造である。先に示したように、Gタンパク質αサブユニットとAC9触媒ドメインの間の主な相互作用界面は、AC9 C2aドメインのヘリックスα′2とα′3が形成する溝にGαsスイッチIIヘリックスが挿入されることによって形成される（図S7、DからF）。 HD領域h1.2（残基340から360）は、Gαs-相互作用表面に近接している（図S7E）。この領域は非常に動的であるように見え、AC9のHis361とPro384をつなぐ残基を解決することはできなかった（図S7E）。しかし、この領域がGタンパク質-AC界面に近いことから、AC9構造のこの要素がAC9とGαsの相互作用に寄与している可能性が高い。

ATP結合部位とフォルスコリン部位内に強い密度の要素を検出した（図3、A、Bおよび図S9、AからC）。この密度はMANT-GTPの密度と表面的には類似しているが、予想された位置とは一致しなかった（図3A）。フォルスコリン部位の密度は、フォルスコリンの予想される位置と重なっているように見えた（図3A）。同様の密度の特徴は、フォルスコリンを含まないサンプルの画像から再構成されたマップにも存在した（図3Bおよび図S9B）。したがって、MANT-GTPおよび／またはフォルスコリンの存在とは無関係に、活性部位およびアロステリック部位は、ペプチドと一致する密度によって占有されているように見える（図3、AおよびB、ならびに図S9、AおよびB）。 3D分類と精密化により、この密度とAC9のC2aドメインのC末端領域との関連が明らかになった（図3C、図S3、図S9C）。この密度の低い3次元クラス（SOL-Cマップ、わずか16,343個の粒子で計算）の密度の特徴は、原子タンパク質モデルを自信を持って構築するほど強力ではないが、利用可能な密度を制約として用いると、AC9 C末端、またはC2bドメインのCys1246からPro1275残基に割り当てられた（図3Cと図S9C）。アロステリック部位と活性部位内の密度の高さ（図3A、図S9、AおよびD）から、AC9のC2bドメインのIle1263からPro1275残基に相当する閉塞ペプチドのモデルを構築することができた（図S9D）。この領域は脊椎動物のAC9ホモログ間で高度に保存されているが（図S9E）、他のACアイソフォーム（AC1〜AC8）にはない（図S10）。

AC9におけるC2bドメインの機能的役割を調べるため、野生型とC2bドメインを除いた切断型タンパク質AC91250の酵素特性を比較した（図3Dおよび図S11A）。 2つのコンストラクトは、ATPをcAMPに変換する能力が同等であり、ミカエリス定数（Km）およびVmax値も同様であった（図3Eおよび表S2）。 AC91250はAC9と同様にフォルスコリンで活性化され、MANT-GTPで阻害された（図S11、B〜D）。 Gαsの添加はAC9によるcAMP産生を強力に刺激し（図3F）、それに伴ってATPに対するKmが増加した。 AC91250は、ATP結合を阻害する尾部によって、高いVmaxを示したが、Km値はかなり低かった(Fig.3F)。これは、AC9のGタンパク質結合状態において、C2b領域が機能的な役割を担っていることを強く示唆している。 C2b領域を除去すると、Gαsの存在下でAC9のATPに対する親和性が高まり、タンパク質はより低いATP濃度で触媒反応の最大速度に到達することができるようになる。 C2bドメインによる活性部位の閉塞による基質（ATP）に対する親和性の低下は、Gタンパク質に結合したAC9によるcAMP産生を制御するための調節機構を表しているのかもしれない。

AC9の閉塞状態での構造変化を評価するために、MANT-GTPとフォルスコリン存在下でのAC91250-Gαs複合体（AC91250-Gαs-MF；図3、G、Hおよび図S12とS13）の低温電子顕微鏡構造を決定した。 4.2Å分解能での再構成により、MANT-GTPとフォルスコリンの結合部位における密度が明確になった（図3、G、H、4；図S13、EからG）。 AC91250-Gαs-MFとAC9-Gas複合体の触媒ドメインの配置を比較すると、活性部位とアロステリック部位におけるオクルージングペプチドの存在に依存して、C1aの相対配置がわずかに変化していた（図1）。 AC9の閉塞状態で観察された微妙なドメイン全体の動きは、ヌクレオチド結合に関与するC1aのアミノ酸残基を約3Åシフトさせた（図S13H）。したがって、AC9のコア触媒ドメインは閉じた状態になり、C2b由来のペプチドがタンパク質の活性部位とアロステリック部位を占め（図S9、DおよびE）、MANT-GTPおよびフォルスコリン結合状態と比較して活性部位が歪んでいることが確認された。

図4 AC9-Gαs複合体の閉塞状態、ヌクレオチドおよびフォルスコリン状態の比較

（AおよびB）閉塞状態、ヌクレオチドおよびフォルスコリン結合状態（AC91250-MPC、青）のAC9 C1aドメインの配置は対応する低温電子顕微鏡構造に基づいている。構造アライメントは、C2aドメインを用いて行った。 C1aドメインの相対的な変位は点線の矢印で示した。 C2bドメインは、(B)において黄色に着色した漫画で示されている。 (C) AC91250のMANT-GTP/2Mn2+とフォルスコリンの3.5Å以内の残基のCα原子を青い球で示した。 (D) AC9の閉塞ペプチド（残基Ile1263からPro1275）の3.5Å以内の残基のCα原子を黄色の球で示した。 (C)と(D)の両構造のリガンドとペプチドの3.5Å以内の残基は赤いラベルで示した。

AC9-Gαs 複合体の閉じた構造から、cAMPに基づくシグナル伝達の確立したモデル（7、26）を再検討することができた（fig. S14）。 GPCRカスケードの活性化により、ACのGαsサブユニット結合型が形成され、cAMPが生成されるはずである。しかし、今回紹介する閉塞状態は、これまで評価されていなかった中間体を追加するものである。 AC9の閉塞状態と活性状態は平衡状態にあると考えられ、閉塞状態の再構成を行った試料は、Gタンパク質によって活性化され、cAMPを生成することができる。また、ATPに対するタンパク質のKmが大幅に減少していることから（図3F）、Gタンパク質が存在するとATP部位の閉塞が促進される可能性があることが示唆された。本研究で明らかになったAC9の構造から、哺乳類ACにおける膜包埋部位の役割の可能性を探る手がかりを得ることができた。膜ドメインの明らかな機能の1つは、活性サイクラーゼの正しい組み立てを可能にすることである。これは、TM6とTM12がHDのフレームを提供することによって達成される。現在のところ分解できないタンパク質の要素、すなわちN末端とC1bドメインが、AC9のサイクラーゼ機能の組み立てと制御に寄与していると思われる（図S6、E〜G）。したがって、触媒ドメインが脂質二重層から約40Å離れているにもかかわらず、タンパク質の膜部分はHDとそれに隣接するループ領域を介して触媒ドメインに影響を与えることができると考えられる。このペプチドの存在は、AC9のフォルスコリン非感受性という矛盾した観察結果（14, 19, 20）を説明するのに役立ち、AC9の文脈依存的な自己調節を支持するものと思われる。フォルスコリンは植物由来の低分子活性化因子であり、ACのこの部位の天然の活性化因子あるいは阻害因子の存在が仮定されているが（20）、今のところ同定には至っていない。 AC9の場合、（i）フォルスコリンは酵素を活性化する能力があること、（ii）アロステリック部位の天然の調節因子と考えられるのは、タンパク質の活性領域に結合するC2bドメインの部分であることを示すことができるようになった。 Gタンパク質による活性化の後（図S14、A〜D）、C2bがAC9反応中心を閉塞して酵素活性を阻害し、細胞内でのcAMPの過剰生成を防いでいることが示唆された（図S14E）。このことは、AC9のC2bドメインが細胞内で自己抑制機能を持つという最近の報告（27）と一致する。今回の発見は、AC9-Gαs構造が明らかにした自己調節分子機構を利用した創薬における新たなアプローチの創出に道を開くものと考えられる。 S1 to S14

Tables S1 and S2

References (28-47)

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