Wheat Aleurone and Bran

Abstract

アラビノキシラン（AX）多糖類の食後グルコース応答に関する研究は、AX構造の多様性により対照的な結果となっている。 そこで、小麦アリューロンおよび小麦ふすまから抽出した4種類の水抽出AX（WEAX）抽出物を用いて、（a）α-アミラーゼおよびα-グルコシダーゼ活性に対するAXの影響、（b）酵素阻害能に及ぼすAX化学成分の影響、および（c）酵素阻害速度の動態を検討した。 α-アミラーゼ活性は、種類や濃度にかかわらず、WEAX画分の存在によって有意な影響を受けなかった。 WEAXはマルトースを基質とした場合のみα-グルコシダーゼ活性を阻害し、スクロースは阻害しなかった。 WEAXのIC50値（- mg/mL）はフェルラ酸含量（），アラビノース/キシロース比（），キシロースの非置換（），二置換（），一置換（）の相対割合に高い相関が認められた． Lineweaver-Burkプロットは非競合的な酵素阻害様式を示唆した。 以上より，WEAXの抗糖化作用はα-グルコシダーゼ活性の直接阻害に起因することが示唆された． はじめに

2型糖尿病の有病率は、世界的に増加しています。 糖尿病は、高い循環血漿グルコースによって特徴付けられる慢性疾患である。 そのため、食後血糖の管理は2型糖尿病患者の予防と治療において重要である。 ヒトを対象とした介入研究により、アラビノキシラン（AX-）を豊富に含む食事の摂取が、健常者、耐糖能異常、および糖尿病患者の食後血糖値を減弱させることが示されている。 一方、Mohligらは、健康なヒト被験者にAXを添加したロールパンを摂取させても、グルコース反応に影響を与えないことを見出した。 動物実験でも、AX 添加の効果についてさまざまな結果が報告されている。 そのメカニズムはまだ不明であるが、水溶性食物繊維が内腔の粘性を高め、それによって栄養吸収を遅らせるということが言われている。 AX溶液の見かけの粘度は、AXの非対称コンフォメーションと分子量、およびポリマー濃度に影響される。 これらの3つの要因のうち、AXの濃度が最も粘度に影響を与えるようである。 したがって、AXの血糖値に対する効果は用量依存的である。 AX溶液の見かけ粘度は、せん断応力にも依存し、せん断応力が大きくなると、非ニュートン流体に特徴的なせん断減粘が生じる。 最近の研究では、AXの粘性効果は強い腸の蠕動運動によって相殺される可能性が示唆されている

AXの分子構造は複雑で不均質である。 AXは、β-D-キシロピラノシル（Xylp）残基とα-L-アラビノフラノシル（Araf）残基がC（O）-2およびC（O）-3および/またはC（O）-2およびC（O）-3位置でキシランバックボーンに（ ）連結したものから構成されています。 キシロース残基はまた、グルクロン酸および/またはメチルグルクロン酸の結合で置換されていてもよい. フェルラ酸またはクマル酸残基はアラビノース残基にC(O)-5位でエステル結合している.また、アラビノース残基はC(O)-5位でエステル結合している. アラビノースとキシロースの比率、アラビノース置換のパターン、フェルロイル化の度合い、分子量は穀物間および穀物内で大きく異なる。 アラビノキシラン（AX）は穀物中の食物繊維の最も高い割合（60-70％）を占め、その含有量は原料または穀物分画によって異なる。 AXは小麦の1.3-2.7%w/wを占めている。 小麦のアリューロンと果皮にはそれぞれ20%と45%のAXが含まれている。 小麦に含まれる AX の多くは水に溶けません (70～86%)。

食餌性炭水化物は、消化管で吸収される前に単糖、グルコース、またはフルクトースに加水分解されます。 デンプンは主に唾液と膵臓のアミラーゼによってマルトースと他の短鎖炭水化物に消化される。 その結果、マルトース、マルトトリオース、α-極限デキストリン）およびスクロースは、小腸ブラシボーダーのα-グルコシダーゼ（マルターゼ-グルコアミラーゼおよびスクラーゼ-イソマルターゼ）によりグルコースまたはフルクトースへと消化される … 小腸における糖の吸収には、主にGLUT2、GLUT5、SGLT1トランスポーターが関与している 。 従って、腸管での糖質の消化・吸収を制限することにより、食後高血糖を低下させることが可能である。 AXの構造には大きな違いがあるにもかかわらず、ほとんどの研究では使用したAXの組成や構造の詳細はほとんど報告されておらず、食後血糖値への影響に関する結果の比較は困難である ……このような背景のもと、AXの食後血糖値への影響に関する研究開発が進められてきた。 また、精製水抽出型AXの糖質消化酵素への影響についても、非常に限られたデータしか存在しない。 そこで本研究では、（a）α-アミラーゼおよびα-グルコシダーゼ活性に対するAXの影響、（b）それらの阻害力に及ぼすAXの化学組成の影響、および（c）酵素阻害のキネティクスについて検討することを目的とした。 材料および方法

2.1. 化学物質および試薬

市販の小麦アリューロン（Grainwise wheat aleurone）はCargill LimitedおよびHorizon Milling（米国カンザス州ウィチタ）から贈与されたものである。 脂質、タンパク質、灰分、デンプンがそれぞれ4.5、15.2、7.4、2.5%で構成されている。 ハードレッド小麦ふすまは、現地でBulk Barn（カナダ、マニトバ州ウィニペグ）から購入した。 水分、灰分、タンパク質はそれぞれ 5.8、5.3、11.1%であった。 小麦非修飾デンプン、マルトース、スクロース、アカルボース、豚膵臓α-アミラーゼ（EC 3.2.1.1, Type VI-B）、アスペルギルス由来アミログルコシダーゼ（EC 3.2.1.3 ）、ラット腸管アセトン粉末はSigma-Aldrich (Milwaukee, WI, USA) から購入した。 硫酸アンモニウム、すべての酸、有機溶媒はFischer Scientific (Whitby, Ontario, Canada)から購入した。 マルトース，スクロース，グルコースアッセイキット（K-MASUG 08/13）は，Megazyme International Ireland（Bray, Wicklow, Ireland）より購入した． 使用したすべての化学物質は、分析グレードまたはHPLCグレードである

2.2. 水抽出アラビノキシランの調製

小麦ふすま及び小麦アリューロン試料（〜200g）を2Lの水性エタノール（80％、v／v）中で85℃、還流下で2時間煮ることにより内在性酵素を不活性化させた。 上澄み液を捨て、残渣をフュームフード中で一晩室温で風乾させた。 Izydorczyk と Biliaderis の方法に従って、45℃で風乾したふすままたはアリューロン（150 g）から水抽出画分を単離した。 この水抽出物をα-アミラーゼ(1821 U/L)で脱塩し、セライトとフラーズアースで脱タンパクした。 精製物を段階的な硫酸アンモニウム（AS）沈殿により分画し、AS飽和度50および75%の分画を得た。 回収した物質は、48時間透析（12kDaカットオフ膜）した後、凍結乾燥した。 小麦アリューロンから回収した水抽出性画分には、（WA）の後に、それらが得られたASの濃度を表示した（WA-f50およびWA-f75）。 同様に、小麦ふすまから採取したもの（WB）は、WB-f50およびWB-f75とした。 WEAXフラクションの化学的および構造的な説明を表1に示す。

2.3. α-アミラーゼ活性阻害試験

小麦でんぷん（300 mg）を1 mM塩化カルシウムを含む15 mLリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.9, 0.1 M）に懸濁し、95℃で15分加熱した。 WEAX画分（40 mg）を2 mLリン酸ナトリウム緩衝液に溶解した。 サンプルは、反応混合物の最終濃度が 0.0, 0.2, 0.3, 0.5% (w/v) となるように希釈された。 等量（200μL）のスターチとWEAX（またはコントロール）を混合し、ボルテックスで攪拌した。 70μLの豚膵臓α-アミラーゼ（130U/mL）および40μLの真菌アミログルコシダーゼ（240U/mL）を加えることにより、デンプンの加水分解を開始させた。 30分後、95℃で5分間加熱して反応を停止させた。 混合物を直ちに氷上で冷却し、遠心分離した（Thermo Scientific, Sorvall Legend Micro21, Germany）。 上清を回収し、Megazymeグルコーステストキットを用いてグルコースを分析した。 ヒトへの介入研究では、0.25から0.70%のAX濃度の有効性が報告されており、それゆえこの濃度範囲を選択した

2.4. ラット腸管α-グルコシダーゼ活性阻害試験

Okiらによるα-グルコシダーゼ阻害法を改変して使用した。 簡単に説明すると、ラット腸管アセトン粉末（500 mg）を10 mLリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.9, 0.1 M）と混合し、氷浴中で30秒間超音波処理（12回）、発熱を防ぐために15秒間休憩した。 その後、この混合物を10000、4℃で10分間遠心分離した。 上清を回収し、ラット腸管α-グルコシダーゼを標識した。 WEAXサンプル（40 mg）を2 mLリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.9, 0.1 M）に溶解させた。 その後、50μLのラット腸管α-グルコシダーゼを100μLのサンプルまたは緩衝液（コントロール）と混合し、37℃で5分間インキュベートした。 50μLの20mMスクロースまたは4mMマルトースを添加し、さらに60分（スクロース）または30分（マルトース）インキュベートした。 WEAX画分の最終濃度は0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.0%(w/v)であった。 95℃、10分間の加熱により酵素活性を停止させた。 10000で10分間遠心分離した後、上清を回収し、Megazyme GOPODグルコーステストキットを用いてグルコース分析を行った。 α-グルコシダーゼ（スクラーゼまたはマルターゼ）阻害率は、.として算出した。 IC50値は、試料濃度に対するα-グルコシダーゼ阻害率の%プロットから求めた。 また、比較のために、既知のα-グルコシダーゼ阻害剤であるアカルボースによるラット腸管α-グルコシダーゼの阻害も行った。 アカルボース濃度は1.625, 3.25, 4.9, 6.5, 9.8, 13 μg/mLを使用した

2.5. 統計解析

すべての解析は六重で行い（他に指示がない限り）、すべての統計はJMP 12統計ソフトウェア（SAS Institute Inc.、Cary、NC）上の一元配置分散分析（ANOVA）を使用して計算した。 サンプル平均はTukey HSD法を用いて比較し、有意差は.Nで決定した。 パラメータ間の相関はピアソンの相関検定を用いて計算した。 結果と考察

デンプンの加水分解に対するWEAXの影響を図1に示した。 WEAX画分の存在下または非存在下でα-アミラーゼとインキュベートして30分間に放出されるグルコースの量を比較した。 WEAX画分の添加により、コントロール処理と比較して、生成されるグルコースの量が数値的に減少した。 しかし、処理群とコントロールの統計的比較では、WA-f50、WA-f75、WB-f75ではWEAX濃度にかかわらず、平均差は有意ではなかった（）。 WB-f50を0.5%添加した場合、コントロールと比較してアミロリシスの有意な減少が認められた()。 しかし、α-アミラーゼ活性については、AXの濃度や種類に起因すると思われる文献上の他の報告とは対照的であった。 澱粉のアミロリシスは1%と2%のAXの存在下で行われ、使用されたAXはフェルラ酸を含まないものであった. AXの濃度は、ヒトの研究で食後血糖値を低下させることが報告されている濃度と同等（～5～10g）を使用した。

Figure 1

水抽出アラビノキシランのデンプンの加水分解に対する影響。

表2は、基質としてスクロースまたはマルトース存在下でのα-グルコシダーゼ活性に対するWEAXの効果を示す。 データはα-グルコシダーゼ活性の50%阻害をもたらす阻害剤の濃度であるIC50で示した。 マルトースを基質とするα-グルコシダーゼ活性に対するIC50値は4.88〜10.14 mg/mLの範囲であった。 しかし、スクロースを基質とした場合には、阻害作用は認められなかった。 また、WEAXの腸管マルターゼに対する阻害力は、陽性対照であるアカルボースと比較して1000〜2000分の1であった。 AXの食後グルコースに対する効果の原因は、粘性にあるのではないかという仮説が有力である。 そこで、Vogelらは、粘性の影響を調べるために、改良小麦ふすまAXをラットに与えた 。 また、AXの単糖/オリゴ糖による腸管αグルコシダーゼの阻害もフェルラ酸部分と関連していた。 したがって、WA-f50とWB-f75は、無置換（un-Xylp）、一置換（2-Xylpまたは3-Xylp）、二置換（2，3-Xylp）のキシロース残基と置換度の相対比率はほぼ同じであるがフェルラ酸含有量が異なるためα-グルコシダーゼ活性に対する阻害力が大きく異なることが確認された。

アラビノース/キシロース比は置換度(DS)の指標となるものである。 DSとIC50の間には強い負の線形関係( = -0.67)が観察された。 これは高いDSによってAXの溶解度が増加した結果であると考えられる。 したがって，高置換度WEAXはIC50値が低い（阻害力が強い）ことが示唆された。 また，非置換キシロース残基の割合と阻害力との間に負の相関があることも，同様の観察から支持された。 ジ-Xyl残基とモノ-Xyl残基の見かけの比率は影響を及ぼさないが、キシロースの置換の程度は影響を及ぼすと考えられる。 したがって、α-グルコシダーゼ活性に対する影響はWEAXのアラビノース残基から生じていると考えられる。 アラビノースはα-グルコシダーゼ活性を阻害するという報告がある。 この仮説を証明するために、アラビノフラノシダーゼを用いてWEAXからアラビノース残基を除去する試みは成功しなかった。 しかし、C (O)-2 のモノ-Xyl は C (O)-3 のモノ-Xyl に比べて主要な決定因子であることに注目し、阻害力は単なるアラビノース残基の存在を超えるものであることが示唆された。 また、C(O)-2 のmono-Xylとフェルラ酸含有量には強い相関があった（= 0.99）。

WEAX存在下および非存在下でのマルトースに対するα-グルコシダーゼ活性の見かけの最大速度（）とミカエリス-メンテン定数（）をLineweaver-Burk plot（図2）により計算したところ、DSの影響はフェルラ酸の影響から派生した可能性があることがわかった。 WEAX画分の影響を分析し、阻害のタイプを決定した。WEAX画分非存在下でのマルトースに対するα-グルコシダーゼの活性は、それぞれ17.5μg glucose per minuteと5.99mMであった。 表4より、WEAX画分を添加すると両者の値が減少したことから、WEAXはα-グルコシダーゼ活性を非競合的に阻害することが示唆された。 非競合的阻害の典型的な特性は、阻害剤の存在下で両者が減少することである。 したがって、WEAX画分は酵素基質複合体に結合し、それによって両者を減少させたと考えるのが妥当であろう。 アラビノースもα-グルコシダーゼ活性を非競合的に阻害することが判明した。

我々の結果は、食後グルコースレベルに対するAXの効果に関する文献に見られる矛盾について説明を与える可能性があります。 Zuker糖尿病ラットにAX (Ara/Xyl = 0.9) 添加パンを与えたところ、食後血糖値が有意に低下した。 一方、AX（Ara/Xyl = 0.5）本来の摂取は、血糖値反応に影響を与えなかった。 また、6gおよび12gのAX（Ara/Xyl = 0.66または0.8）を添加した食事は、健康者および糖尿病患者の両方で血糖値を低下させた。 しかし、AX（Ara/Xyl = 0.8）は、健康なヒト成人において食後のグルコース反応を減弱させることはなかった。 AXを添加した白パンを食べた豚は、白パンを食べた豚と比較して、正味のグルコースフラックスが減少していた。 AXの有効性については、詳細な化学組成や構造が不明であるため、比較することが困難である。 そのため、使用するAXの濃度が同じであっても、その効果は使用するAXの性質に依存すると考えられる。 その結果、硫酸アンモニウム飽和度50%で得られたAXは75%で得られたAXに比べて高い阻害力を示した。 結論

本研究の結果、アラビノキシランはアミラーゼ活性ではなく腸内α-グルコシダーゼ活性を阻害することによって抗血糖作用を示す可能性が示唆された。 水抽出AXのα-グルコシダーゼ活性に対する効力は、フェルラ酸含有量、アラビノース/キシロース比、キシロース置換パターンにより影響を受けた。 また、α-グルコシダーゼ活性の阻害は非競合的なメカニズムで起こることが示唆された。 したがって、水抽出性AXを豊富に含む食事の摂取は食後血糖値を減衰させる可能性がある

開示

成果の一部は、2016年4月20日から22日までセント・ボニファス病院アルブレヒト研究センターで開催された機能性食品・天然健康食品卒業研究（FFNHP）シンポジウム／機能性食品・生物活性の治療応用（TAFFB）会議にて口頭ポスター発表されました。

利益相反

受け取ったすべての資金または材料支援は、この原稿の出版に利益相反をもたらすものではなかった

謝辞

この研究は、カナダ自然科学・工学研究会議（NSERC）による発見助成プログラムによって資金提供されたものです。 また、小麦アリューロンサンプルの提供を受けた Cargill Limited、技術的支援を受けたマニトバ大学食品科学科の Ce Zhou、Alison Ser、Pat Kenyon に感謝する

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