Abstract
Studi precedenti hanno dimostrato che l’apporto di colina è direttamente collegato all’obesità indotta da una dieta ricca di grassi e alla resistenza all’insulina nei topi. Lo scopo di questo studio era di valutare se l’apporto di colina potesse anche modulare l’obesità e l’insulino-resistenza causate da un difetto genetico. Topi maschi ob/ob di otto settimane sono stati alimentati per due mesi con una dieta carente di colina o integrata con colina. Il peso del tessuto, compresa la massa grassa e la massa magra, è stato valutato. La segnalazione intracellulare, il glucagone e l’insulina plasmatici e i test di tolleranza al glucosio e all’insulina sono stati analizzati. La dieta carente di colina ha rallentato l’aumento del peso corporeo e diminuito la massa grassa. La carenza di colina ha anche diminuito il livello di glucosio nel plasma e migliorato la tolleranza al glucosio e all’insulina, anche se il fegato grasso è stato esacerbato. Aumento dell’attività lipolitica adiposa, diminuzione del glucagone plasmatico e ridotta espressione del recettore epatico del glucagone sono stati osservati anche con la dieta carente di colina. I nostri risultati dimostrano che una dieta carente di colina può diminuire la massa grassa e migliorare la tolleranza al glucosio nei topi obesi e diabetici causati da un difetto genetico.
1. Introduzione
La colina è un importante fattore dietetico, che è coinvolto in alcuni processi cruciali come la biosintesi del neurotrasmettitore acetilcolina e il principale componente di membrana fosfatidilcolina (PC). La PC può essere sintetizzata sia dalla via della CDP-colina che attraverso la metilazione della fosfatidiletanolamina da parte della fosfatidiletanolamina N-metiltransferasi (PEMT). La via PEMT è quantitativamente significativa solo nel fegato. La colina è anche un precursore essenziale del neurotrasmettitore acetilcolina, che agisce attraverso i recettori muscarinici e nicotinici dell’acetilcolina. Negli ultimi anni, un possibile legame tra colina e obesità/diabete è diventato evidente. Il potenziale dei recettori muscarinici dell’acetilcolina come bersaglio terapeutico dell’obesità è stato proposto. Recentemente, abbiamo scoperto che la carenza di PEMT potrebbe proteggere i topi dall’obesità indotta dalla dieta ad alto contenuto di grassi e dalla resistenza all’insulina. Tuttavia, questa protezione è scomparsa quando una dose elevata di colina è stata aggiunta alla dieta ad alto contenuto di grassi. La via PEMT seguita dal catabolismo PC è l’unica via biosintetica conosciuta per la colina nei mammiferi. Una significativa diminuzione del contenuto di colina in diversi tessuti è stato trovato in PEMT-deficienti topi (Li et al., dati non pubblicati), fornendo un collegamento diretto tra colina e alto grasso-dieta indotta obesità / insulino-resistenza. Nello studio attuale, abbiamo alimentato i topi ob/ob con una dieta carente di colina (CD) per valutare se la carenza di colina potrebbe anche modulare l’obesità e l’insulino-resistenza di origine genetica.
2. Materiale e metodi
2.1. Animali e dieta
Tutte le procedure sono state approvate dall’Institutional Animal Care Committee dell’Università di Alberta in conformità alle linee guida del Canadian Council on Animal Care. Topi maschi ob/ob di 8 settimane provenienti dal Jackson Laboratory sono stati acclimatati per 1 settimana. Sono stati utilizzati 5 topi in ogni gruppo. I topi hanno avuto libero accesso a diete carenti di colina (CD) o integrate con colina (CS) per 2 mesi. La dieta CD (MP Biomedicals Canada, catalogo n. 901387) conteneva il 20% di grasso come strutto. La dieta CS consisteva nella dieta CD a cui è stato aggiunto lo 0,4% (w/w) di cloruro di colina. I topi sono stati sacrificati mediante anestesia con isoflurano, seguita da puntura del cuore.
2.2. Aumento del peso corporeo, misurazione della massa magra e della massa grassa
Il peso corporeo è stato misurato settimanalmente. La massa magra e la massa grassa sono state analizzate, 2 mesi dopo che i topi sono stati messi a dieta (premortem), usando il sistema EchoMRI.
2.3. Test di tolleranza al glucosio e all’insulina
Test di tolleranza al glucosio: dopo un digiuno di 12 ore, i topi hanno ricevuto un’iniezione intraperitoneale (i.p.) di 0,5 g di destrosio/kg di peso corporeo sciolto in una soluzione salina tampone fosfato sterilizzata (PBS). Test di tolleranza all’insulina: dopo un digiuno di 6 ore, i topi hanno ricevuto un’iniezione i.p. di 1,0 unità di insulina (Sigma)/kg di peso corporeo in PBS. Le concentrazioni di glucosio nel sangue sono state misurate da un glucometro nelle code prima e nei momenti indicati dopo l’iniezione.
2.4. Misurazioni dell’attività del complesso mitocondriale I/II
Le attività del complesso mitocondriale I e II sono state determinate usando la proteina mitocondriale. Brevemente, per isolare la proteina mitocondriale, i campioni sono stati tenuti in ghiaccio e omogeneizzati in un tampone contenente 75 mM di saccarosio, 225 mM di sorbitolo, 1 mM di EGTA e lo 0,1% di albumina di siero bovino senza acidi grassi in 10 mM di Tris-HCl pH 7,4. L’omogeneizzato è stato centrifugato a 600 × g per 15 min, e il surnatante risultante è stato ulteriormente centrifugato per 20 min a 16.200 rpm. La proteina mitocondriale nel pellet è stata sospesa in un tampone contenente 20 mM Tris e 25 mM saccarosio (pH7.4) e conservata a -80°C fino all’utilizzo. La misurazione dell’attività è stata eseguita in uno spettrofotometro per un periodo di 5min come diminuzione dell’assorbanza a 600nm dovuta alla riduzione del 2,6-diclorofenolo-indofenolo (DCPIP) a ubichinone-1 in presenza di NADH (substrato del complesso I) o succinato (substrato del complesso II) di conseguenza. La reazione è stata effettuata in presenza di antimicina e cianuro di potassio come inibitore del complesso III e del complesso IV. Il Rotenone, come inibitore del complesso I, è stato anche coinvolto nel buffer di reazione per l’attività del complesso II.
2.5. Istologia e Immunoblotting
Per l’istologia, i fegati o i cuscinetti di grasso sono stati sezionati in formaldeide al 10% in PBS, quindi seguiti dalla colorazione di routine di ematossilina ed eosina. Per l’immunoblotting, dopo l’omogeneizzazione e la centrifugazione a 600× g dei campioni di fegato, i surnatanti risultanti sono stati sottoposti a determinazione della concentrazione proteica (BioRad) per garantire una pari quantità di proteine è stato caricato a SDS-PAGE. Tutti gli anticorpi primari contro la lipasi ormono-sensibile (fosfo-HSL / totale HSL), fosfoenolpiruvato carbossichinasi, (PEPCK), Acetil-CoA carbossilasi (fosfo-ACC / totale ACC), e AMP-attivato protein chinasi (fosfo-AMPK / totale AMPK) sono acquistati da Cell Signaling. Anticorpi per piruvato deidrogenasi chinasi isoenzima 4 (PDK4), recettore del glucagone sono stati ottenuti da Abcam, ma soppressore di segnalazione citochina 3 (SOCS3) e PGC-1α erano da Santa Cruz Biotechnology.Tublin o actina è stato utilizzato come controlli di carico per la normalizzazione. L’immagine è stata analizzata dal software ImageJ.
2.6. Misurazione dell’insulina e del glucagone nel plasma
Le misurazioni sono state eseguite utilizzando un kit per il dosaggio del glucagone e dell’insulina nel topo/ratto (Meso Scale Discovery) in base alle istruzioni dell’azienda.
2.7. Analisi statistica
I dati sono mostrati come media ± SD. Le differenze sono state valutate utilizzando il test t di Student. Un valore di 𝑃<0,05 è stato considerato significativo.
3. Risultati
La dieta carente di colina ha rallentato significativamente l’aumento del peso corporeo fino a 2 mesi (Figura 1(a)) senza influenzare il consumo di cibo (assunzione giornaliera di cibo 7,21±1,23 g per topi CD contro 7,39±1,31 g per topi CS, 𝑃>0,05). C’era una differenza significativa nel peso corporeo iniziale tra i due gruppi (30,42±1,70 g per i topi CD contro 26,3±2,26 g per i topi CS, 𝑃=0,01). La carenza di colina non ha influenzato il peso di cuore, fegato o reni (Figura 1(b)), ma c’è stata una significativa diminuzione del peso del grasso epididimale e perirenale (Figura 1(c)). Un’ulteriore analisi, utilizzando la risonanza magnetica, ha mostrato che la carenza di colina ha diminuito la massa grassa del corpo intero e tuttavia ha aumentato la massa magra, non importa espressa come massa assoluta o percentuale relativa alla massa del corpo intero (Figura 1(d)). La carenza di colina ha aumentato l’espressione della lipasi sensibile ai fosfoormoni del tessuto adiposo, una forma attivata dell’enzima (Figura 1(e)). La carenza di colina, d’altra parte, non ha cambiato la morfologia del tessuto adiposo (Figura 1(f)).
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La colinacarente attenua l’aumento di peso corporeo e aumenta la capacità lipolitica adiposa. Topi maschi ob/ob di 8 settimane hanno avuto libero accesso a diete CD o CS per 2 mesi. Sono stati misurati l’aumento di peso corporeo (a), il peso dei tessuti (b), il peso del grasso epididimale e perirenale (c), la massa grassa e la massa magra (d). L’espressione proteica della lipasi fosfo-sensibile e totale nel tessuto adiposo è stata valutata mediante immunoblotting (e). Le sezioni dei cuscinetti adiposi sono state colorate con H & E (f). ∗∗𝑃<0.01 e ∗𝑃<0.05 rispetto al gruppo CS.
Oltre a influenzare il peso corporeo, la carenza di colina ha anche diminuito il glucosio plasmatico a digiuno (14,3±1,67 contro 10,8±1,19, 𝑛=5, 𝑃<0,05) e il livello di glucagone (Figura 2(a)), anche se non ha avuto alcun effetto sul livello di insulina nel plasma (Figura 2(b)). Un intolleranza al glucosio e all’insulina significativamente migliorata è stata osservata nei topi con dieta carente di colina (Figure 2(c)-2(d)). Per indagare il meccanismo sottostante, sono stati analizzati gli enzimi chiave per l’ossidazione del glucosio. La carenza di colina ha ridotto l’espressione proteica epatica di PDK4 (Figura 3(a)), un regolatore negativo dell’attività della piruvato deidrogenasi che controlla l’afflusso di acetil-CoA mitocondriale, il che indica una maggiore utilizzazione del glucosio. Allo stesso modo, il PGC-1α epatico (un noto modulatore a monte di PDK4) e PEPCK (un bersaglio a valle di PGC-1 α e un enzima chiave per la gluconeogenesi) sono stati ridotti (Figura 3(b)), suggerendo una diminuzione della gluconeogenesi. Inoltre, abbiamo indagato se il miglioramento del glucosio e l’intolleranza all’insulina potrebbero essere associati con l’alterazione dell’infiammazione epatica e la funzione mitocondriale. Né l’espressione proteica di SOCS3 (Figura 3(c)), un marcatore di pro-infiammazione, né l’attività della citrato sintasi mitocondriale è stata influenzata (dati non mostrati). Tuttavia, l’attività del complesso mitocondriale II, ma non del complesso I, è stata significativamente diminuita dalla carenza di colina (Figura 3(d)). È interessante notare che anche l’espressione proteica del recettore epatico del glucagone è stata diminuita dalla carenza di colina (Figura 3(e)).
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Colina-dieta carente migliora l’intolleranza al glucosio e all’insulina. Topi maschi ob/ob di 8 settimane hanno avuto libero accesso alle diete CD o CS per 2 mesi. Il livello di glucagone plasmatico a digiuno (a) e di insulina (b) è stato misurato. Sono stati eseguiti il test di tolleranza al glucosio intraperitoneale (c) e il test di tolleranza all’insulina (d). ∗∗𝑃<0.01 e ∗𝑃<0.05 rispetto al gruppo CS.
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Meccanismi molecolari coinvolti nel miglioramento della sensibilità all’insulina nei topi ob/ob con dieta carente di colina.dieta carente. Topi ob/ob maschi di 8 settimane hanno avuto libero accesso a diete CD o CS per 2 mesi. L’espressione proteica epatica di PDK4 (a), PEPCK, PGC-1α (b), SOCS3 (c), e recettore del glucagone (e) è stata valutata mediante immunoblotting. Sono state misurate anche le attività del complesso mitocondriale I e II (d). ∗𝑃<0.05 rispetto al gruppo CS.
Anche se il miglioramento della tolleranza al glucosio, la carenza di colina esacerba il fegato grasso, sostenuto da analisi istologiche e aumento della massa di trigliceridi epatici (Figura 4(a)). Per comprendere i meccanismi alla base del fegato grasso indotto dalla carenza di colina, abbiamo esaminato gli enzimi coinvolti nella β-ossidazione degli acidi grassi e nella lipogenesi. La carenza di colina ha aumentato l’attività epatica della glicerolo-3-fosfo-aciltransferasi (GPAT) (Figura 4(b)) e ha diminuito l’attività della β-idrossiacil-CoA deidrogenasi (β-HAD) (Figura 4(c)), un enzima chiave della β-ossidazione degli acidi grassi, che indica che più acidi grassi intracellulari sono stati incanalati nella biosintesi dei lipidi piuttosto che nell’ossidazione. Questa nozione è stata ulteriormente supportata da una diminuzione dell’espressione epatica di fosfo-AMPK e fosfo-ACC (Figura 4(d)), che quindi attiva ACC e aumenta la lipogenesi epatica.
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Meccanismi molecolari coinvolti nello sviluppo del fegato grasso nei topi ob/ob con dieta carente di colina.dieta carente. Topi ob/ob maschi di 8 settimane hanno avuto libero accesso a diete CD o CS per 2 mesi. Le sezioni del fegato sono state colorate con il protocollo di colorazione H & E, e la quantità di trigliceridi epatici è stata misurata (a). Le attività di glicerolo-3-fosfato-aciltransferasi (GPAT) (b) e β-idrossil acil-CoA deidrogenasi (β-HAD) (c) sono state valutate. L’espressione proteica di fosfo-AMPK e fosfo-ACC è stata monitorata (d). ∗𝑃<0.05 rispetto al gruppo CS.
4. Discussione
Nel lavoro precedente, abbiamo dimostrato che l’integrazione di colina è legata all’obesità indotta dalla dieta ad alto contenuto di grassi e alla resistenza all’insulina nei topi con deficit di PEMT. Recentemente, abbiamo scoperto che la resistenza all’insulina indotta dalla colina è specifica per la colina, non solo nei topi wild-type ma anche nei topi carenti di PEMT (Wu e Vance et al. dati non pubblicati). Nello studio attuale, abbiamo studiato l’impatto della privazione di colina sui topi ob/ob. Abbiamo dimostrato cinque nuovi effetti della carenza di colina: (1) aumento dell’attività lipolitica adiposa; (2) miglioramento dell’ossidazione del glucosio; (3) diminuzione dell’ossidazione epatica degli acidi grassi; (4) espressione downregolata del recettore epatico del glucagone; (5) ridotta attività mitocondriale epatica del complesso II.
4.1. La carenza di colina attenua l’aumento di peso corporeo
La carenza di colina attenua significativamente l’obesità indotta dalla dieta ad alto contenuto di grassi nei topi Pemt-/- e l’aumento di peso nei topi ob/ob. Tuttavia, Raubenheimer et al. hanno riferito che la carenza di colina non ha influenzato l’aumento di peso o il peso del tessuto adiposo. La differenza tra i due studi potrebbe essere dovuta a differenze nei modelli animali e nei protocolli di alimentazione. Nello studio di Raubenheimer, i topi C57Bl/6 sono stati alimentati con una dieta ad alto o basso contenuto di grassi per 8 settimane, ma i topi hanno ricevuto la dieta CD o CS solo per le ultime 4 settimane. I nostri topi ob/ob sono stati alimentati con la dieta ad alto contenuto di grassi CD o CS per 8 settimane. In letteratura, entrambi i topi ob/ob maschi e femmine sono stati ampiamente utilizzati in studi metabolici, come l’aumento di peso corporeo e la sensibilità all’insulina epatica (e muscolare), e non è stato riportato alcun effetto di genere significativo. Nel nostro studio, sono stati utilizzati solo topi ob/ob maschi.
Il nostro studio attuale dimostra che la colina può anche modulare l’obesità di origine genetica. Poiché la carenza di colina non ha influenzato il consumo di cibo, l’aumento dell’attività lipolitica adiposa (maggiore espressione della lipasi attiva ormono-sensibile) può spiegare la riduzione della massa grassa e l’aumento del peso corporeo. Inoltre, non possiamo escludere le possibilità che la carenza di colina potrebbe migliorare il dispendio energetico o l’espressione di UCP1 nel tessuto adiposo marrone e UCP2/UCP3 nel muscolo scheletrico, che sono potenziali fattori che contribuiscono alla diminuzione dell’aumento di peso corporeo. La carenza di colina migliora la tolleranza al glucosio
In contrasto con l’integrazione di colina, che è legata alla resistenza all’insulina indotta dalla dieta ad alto contenuto di grassi nei topi, la carenza di colina ha migliorato la tolleranza al glucosio nei topi ob/ob. Questo è coerente con lo studio di Raubenheimer, dove i topi C57Bl/6 con una dieta ad alto contenuto di grassi CD avevano livelli di insulina diminuiti e una migliore tolleranza al glucosio rispetto alla dieta ad alto contenuto di grassi integrata con colina. Il glucagone plasmatico elevato si trova di solito nei pazienti diabetici di tipo 2. L’iniezione di colina ha aumentato i livelli plasmatici di insulina e glucagone nei ratti. Al contrario, la carenza di colina nel nostro studio ha diminuito il glucagone plasmatico e diminuito l’espressione del recettore del glucagone. Poiché negli ultimi anni gli antagonisti del recettore del glucagone sono stati proposti come potenziali farmaci terapeutici per il diabete di tipo 2, così diminuita espressione proteica del recettore del glucagone in topi ob/ob su dieta carente di colina, in qualche misura, può spiegare la tolleranza al glucosio migliorata. La diminuzione dell’espressione epatica di PGC-1α era concomitante con una downregulation di PEPCK e PDK4, indicando una diminuzione della produzione di glucosio e un aumento dell’ossidazione del glucosio. La down-regolazione dell’attività del β-HADH ha suggerito una diminuzione dell’ossidazione degli acidi grassi. Questi processi sono stati accompagnati da una diminuzione dell’attività del complesso II mitocondriale, che può riflettere una risposta compensatoria alla riduzione dello stress ossidativo mitocondriale. Così, la tolleranza al glucosio migliorata da CD era dovuta alla diminuzione della produzione epatica di glucosio e all’aumento dell’utilizzo del glucosio. Questo potrebbe avvenire attraverso la soppressione del recettore epatico del glucagone, che regola AMPK attraverso l’adenilato ciclasi, modulando così PGC-1α e i suoi obiettivi a valle, come PEPCK e PDK4, così come la capacità di trasporto elettronico mitocondriale epatico. Quindi, ulteriori indagini sono necessarie per dimostrare se il recettore del glucagone potrebbe essere un nuovo bersaglio terapeutico per il diabete.
4.3. La disconnessione tra fegato grasso e resistenza all’insulina
Il fegato grasso ha dimostrato di essere un predittore indipendente dall’obesità del diabete di tipo 2. Si pensa che l’aumento degli acidi grassi intracellulari abbia un ruolo causale nell’insulino-resistenza epatica. Nello studio attuale, la carenza di colina ha esacerbato il fegato grasso, in cui è stata osservata una diminuzione dell’attività della β-idrossiacetil CoA deidrogenasi e un aumento dell’attività della glicerolo palmitoil-acetil transferasi, suggerendo un ruolo della colina nella modulazione del metabolismo degli acidi grassi. Quindi, il reindirizzamento degli acidi grassi nello stoccaggio epatico dei trigliceridi può essere un meccanismo protettivo iniziale per abbassare le concentrazioni intracellulari epatiche degli acidi grassi. La carenza di colina a lungo termine, tuttavia, è collegata all’epatosteatosi, al rischio di difetti del tubo neurale, nonché al rischio di cancro e alla perdita di memoria, il che può limitare l’uso di una dieta carente di colina come strategia terapeutica a lungo termine per l’obesità e l’insulino-resistenza.
In conclusione, la carenza di colina può prevenire l’aumento di peso corporeo e migliorare la tolleranza al glucosio nei topi ob/ob. Una modesta restrizione dell’assunzione di alimenti ad alto contenuto di colina può beneficiare i pazienti obesi, prediabetici e diabetici. I nostri risultati suggeriscono nuovi possibili approcci terapeutici.
Abbreviazioni
| PC: | Fosfatidilcolina |
| PEMT: | Phosphatidylethanolamine N-methyltransferase |
| CD: | Carenza di colina |
| CS: | Integratore di colina |
| HSL: | Lipasi sensibile agli ormoni |
| PEPCK: | Phosphoenolpyruvate carboxykinase |
| ACC: | Acetyl-CoA Carboxylase |
| AMPK: | AMP-activated protein kinase (AMPK) |
| PDK4: | Pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 4 |
| SOCS3: | Suppressor of cytokine signaling 3 |
| GPAT: | Glycerol-3-phospho-acyltransferase. |
Contributo degli autori
G. Wu e L. Zhang hanno contribuito equamente.
Author Disclosure
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione (MOP 89793) del Canadian Institutes of Health Research.